THÉMATIQUE À TAPERANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418 // 57
Principe et applications de la microdissection laser en histopathologie
a Inserm UMR_S728Institut universitaire d’hématologie1, av. Claude-Vellefaux - 75010 Paris b Université Paris-DiderotCampus Jussieu2, place Jussieu - 75005 Paris c Pôle Biologie-PathologieHôpital Saint-Louis (AP-HP)1, av. Claude-Vellefaux - 75010 Paris d CNRS UMR_S7212, Laboratoire associé N11 du Comité de Paris de la Ligue contre le cancerInstitut universitaire d’hématologie1, av. Claude-Vellefaux - 75010 Paris e Inserm UMR_S944Institut universitaire d’hématologie1, av. Claude-Vellefaux - 75010 Paris f CEA – iRSTV/EDyP 17, rue des Martyrs - 38054 Grenoble cedex g Inserm UMR_S88017, rue des Martyrs - 38054 Grenoble cedex
Les tissus biologiques normaux sont constitués de différentes popula-tions de cellules adoptant une architecture souvent très intriquée. Ceci entraîne une grande hétérogénéité dans la composition de chaque tissu. La microdissection laser permet, sous contrôle de la vue et de l’expertise du pathologiste, de sélectionner une population ou une région cellulaire d’intérêt sur tous types de prélèvements tissulaires. Elle répond ainsi au besoin de s’affranchir de l’hétérogénéité cellulaire caractérisant aussi les tissus cancéreux où sont disséminées cellules stromales, cellules précancéreuses, cellules cancéreuses et cellules normales résiduelles. Grâce aux développements technologiques qui n’ont fait que croître durant la décennie qui vient de s’écouler dans le domaine de la biologie moléculaire, cette technique a permis de préciser le rôle important des acides nucléiques (ADN et ARN) et de certaines protéines quali� ées de marqueurs biologiques dans des mécanismes physiopathologiques. C’est en pathologie tumorale que la microdissection laser démontre à l’heure actuelle ses performances dans de nombreux champs d’application dont l’intérêt sera ici précisé.
Microdissection laser – histopathologie – assurance qualité – congélation – inclusion en paraffi ne – ADN – ARN –
protéines – analyses moléculaires.
SUMMARY
The laser microdissection technique: Principle and applications in pathologyNormal tissues are composed of different types of cells leading to complex heterogeneous areas. Under the control of a pathologist, laser microdis-section is a powerful tool for procuring near-pure populations of targeted cell types from speci� c microscopic regions, or even from a single cell of interest of any tissue sections. This technique, whose main applications will be shown there, is thus able to selectively compare stromal cells and tumor cells in a cancer disease. Within the bene� t of new advances in molecular technolo-gies, it has allowed more precise and reprodu-cible analyses during the past decade and has brought new insights to the understanding of a crucial role of DNA, RNA and proteins rather now recognized as biological markers in the tumor area investigations.
DNA – RNA – proteins – molecular biology analyses.
Luc Legrèsa,b,*, Mariana Varnaa,b, Fatiha Bouhidela,b,c, Christophe Lebœufa,b, Philippe Ratajczaka,b,c, Nathalie Martina,b,c,Louis-François Plassab,c,d,e, Hany Solimanb,c,d,e, Elisabeth Turpinb,c,d,e, Jacqueline Lehmann-Cheb,c,d,e, Hugues de Théb,c,d,e, Magali Courtf,g, Christophe Masselonf,g, Jérôme Garinf,g, Anne Janina,b,c, Philippe Bertheaua,b,c
1. Introduction
L’examen d’un tissu biologique au microscope photonique révèle sa complexité histologique qu’il soit tumoral ou non, re� étant souvent une forte hétérogénéité cellulaire. Un tissu tumoral est dans la plupart des cas constitué de cellules tumorales disséminées au sein d’un tissu conjonctif appelé stroma, lui-même composé d’un tissu � breux de soutien, de vaisseaux, d’éléments in� ammatoires et éventuelle-ment de zones de nécrose ou d’hémorragie. Il apparaît nécessaire de s’affranchir de cette hétérogénéité lorsque l’on souhaite faire porter l’analyse sur un échantillon de tissu parfaitement homogène, ne contenant par exemple que des cellules tumorales, ou à l’inverse que des cellules du stroma de la tumeur.Les prélèvements tissulaires d’origine humaine, qui sont plus maintenant le résultat de biopsies effectuées sous contrôle radiologique ou échographique, se limitent bien souvent à des échantillons de très petite taille. Ces prélè-vements deviennent de plus en plus fréquents car il s’agit
58 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418
Dossier scientifi que
d’examens peu invasifs permettant un diagnostic précoce des tumeurs. De fait, ils sont d’autant plus précieux qu’ils sont petits, ce qui a inévitablement entraîné la nécessité d’une miniaturisation des techniques d’analyses pour les caractériser au mieux.Développée en 1996, la microdissection laser répond d’une part au besoin de pureté de l’échantillon analysé grâce à un contrôle histopathologique instantané du matériel prélevé, et d’autre part à cette nécessité de miniaturisation des techniques applicables aux analyses moléculaires effec-tuées sur de très petites quantités après dissociation du tissu. Elle a pour objectif de récupérer certaines cellules d’intérêt sélectionnées sous le contrôle d’un microscope à partir d’une coupe tissulaire complexe en vue d’ana-lyses moléculaires sur le matériel biologique extrait [1]. L’engouement et le développement de cette technique ont été potentialisés par la rapidité de récupération des échantillons et par la pureté de ces échantillons étudiés, évitant ainsi les risques de contamination par d’autres cel-lules voisines dans des analyses de biologie moléculaire faites en aval comme la PCR [2]. De fait, béné� ciant d’une évolution technologique croissante, cet outil performant a permis de diminuer la quantité de matériel prélevé tout en
améliorant la qualité nécessaire pour réaliser des analyses plus pointues et reproductibles.
1.1. Le principe de la microdissectiontissulaireQuand la microdissection tissulaire était effectuée manuel-lement, assistée ou non par micromanipulateur, on grattait sous contrôle d’un microscope photonique à l’aide d’une pointe ef� lée une région d’une coupe tissulaire déposée sur une lame d’histologie [3]. L’évolution technologique de cette approche par l’utilisation d’un faisceau laser a grandement permis d’augmenter la précision avec laquelle le matériel biologique est collecté (fi gure 1). La sélection de l’échantillon se fait toujours au microscope, sous le contrôle et l’expertise du pathologiste dont le rôle est pri-mordial à ce stade de l’identi� cation des cellules ou des régions d’intérêt, mais l’informatisation quasi complète du processus allant de l’observation à la récupération de fragments biologiques en a grandement favorisé son développement et ses facilités d’approche. Des colorations standards peuvent être utilisées sans dif� culté si l’objectif est l’ampli� cation de l’ADN [4], mais elles ne doivent être employées qu’avec précaution et après test préalable si l’objectif est l’étude des ARN ou des protéines. Il est également possible d’utiliser des techniques de marquage immunohistochimique, voire d’immuno� uorescence pour sensibiliser la mise en évidence de cellules d’identi� cation morphologique dif� cile, ou peu nombreuses [5]. Il faut cependant utiliser des techniques rapides en limitant les étapes pour éviter la dégradation des produits biologiques, dits « produits dérivés » (ADN, ARN et protéines essentielle-ment), sur lesquels les analyses vont porter. Le prélèvement de la zone d’intérêt doit répondre à une double exigence : la nécessité d’obtenir une quantité suf� sante de matériel tissulaire et une assurance de la qualité de ce matériel pour les analyses moléculaires ultérieures.
1.2. Les différents systèmesMise en place il y a un peu plus de 10 ans, la microdissec-tion laser a maintenant gagné l’enthousiasme des utilisa-teurs grâce à sa facilité d’approche liée à une automatisa-tion de quasiment tous les systèmes proposés. Selon les modèles, un microdissecteur laser se caractérise par un microscope (droit ou inversé) couplé à un faisceau laser (de longueur d’onde dans l’infrarouge ou l’ultraviolet), dont le fonctionnement est sous la commande d’un programme informatique. Sous contrôle optique, à différents grossis-sements, une caméra reliant le microscope à l’ordinateur, une ou plusieurs cellules bien caractérisées peuvent être virtuellement sélectionnées sur l’écran de l’ordinateur à l’aide d’un assistant graphique. Les éléments cellulaires ainsi isolés sont ensuite découpés sur commande par un faisceau laser avec une précision de l’ordre du micron avant d’être � nalement récupérées dans un tube classique (tube Eppendorf®) ou sur un support particulier (capsule ou tube spécial) selon les appareils.La technologie de la microdissection laser est fondée sur des principes différents selon le système d’appareil utilisé. Quatre sont actuellement disponibles.• Le premier, le système LCM pour Laser Capture Micro-dissection (système PixCell IIe®, et plus récemment le
Figure 1 – Microdissection manuelle et assistée par laser.
Comparaison des deux techniques de microdissection, l’une manuelle où la coupe tissulaire est grattée à l’aide d’une pointe ef� lée (a, b, c) et l’autre, assistée d’un faisceau laser, qui permet de découper et de récupérer une zone tissulaire avec une plus grande précision (d, e, f).
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418 // 59
ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES
système Veritas™ de Arcturus Engineering, Inc., site : http://www.alphelys.com/site/fr/pMDL_intoduction.htm) a été initialement conçu et développé dès 1996 comme outil de recherche au National Institute of Health (NIH), l’Institut national de la Santé aux États-Unis [6]. Le recueil des fragments tissulaires se fait par adhérence sur un � lm thermosensible exposé à un laser infrarouge (IR) continu de basse énergie (λ = 980 nm). Les coupes tissulaires, prépa-rées selon les techniques conventionnelles développées dans un service d’anatomie pathologique, sont étendues sur une lame histologique ordinaire. Spécialement déve-loppées pour cet usage, des capsules (CapSure™ HS, Arcturus Engineering, Inc., États-Unis) recouvertes de ce � lm sont alors placées au contact des zones d’intérêts (fi gure 2). Élaboré à partir d’un microscope droit, ce sys-tème focalise le faisceau laser à travers la capsule pour faire fondre le � lm sur des cellules d’intérêts par une série d’im-pacts dans le périmètre d’une zone de diamètre préétabli (7,5 ; 15 ou 30 μm). Ces cellules adhèrent alors au � lm lorsque la capsule est soulevée de la coupe tissulaire et sont ensuite solubilisées dans le tampon approprié selon les protocoles envisagés (extraction, lyse,…) pour l’analyse des produits dérivés qui auront été extraits. La microdissection avec le Veritas™ représente un nouveau standard qui combine pour la première fois dans un même instrument un laser IR et le laser ultra-violet (UV), rendant ainsi envisageable la destruction de cellules potentiellement contaminantes ou d’une région tissulaire non souhaitée.• Le deuxième système, le LMPC pour Laser Microdis-section and Pressure Catapulting (Carl Zeiss MicroImaging GmbH - PALM Microlaser Technologies, Munich, Allemagne, site : http://www.palm-mikrolaser.com), est constitué d’un microscope inversé associé à l’utilisation d’un laser ultraviolet (UV-A pulsé, λ = 337 nm). Le nouveau système utilise maintenant une longueur d’onde de 355 nm pour un laser UV diode, ce qui permet de travailler bien en dehors des longueurs d’onde d’absorbance des acides nucléiques et des protéines. La coupe histologique peut être déposée directement sur une lame de verre, simple-ment lavée et dégraissée, mais les lames SuperFrost® qui favorisent l’adhérence des coupes de tissus à leur surface grâce à des liaisons chimiques sont en revanche à proscrire. L’utilisation de lames de verre spécialement conçues (Membrane Slides®) peut permettre un meilleur recueil des fragments microdisséqués. Ces lames sont recouvertes d’une � ne membrane (1,36 µm d’épaisseur) sur toute leur surface sauf au niveau d’un large rectangle central où est déposée la coupe tissulaire qui n’adhère que sur cette membrane. Selon certains paramètres réglant l’énergie et la focalisation, le faisceau laser va d’abord permettre le découpage de la zone tissulaire d’intérêt. Puis, par simple augmentation de l’énergie et défocalisation du plan d’action du faisceau laser, la zone découpée est catapultée vers le capuchon d’un tube classique contenant 15 à 25 µL d’un tampon approprié positionné à quelques millimètres à l’aplomb des cellules à récupérer qui vont venir s’y déposer [7] (fi gure 3).• Le troisième système, le Laser Microdissection System LMD (Leica Microsystems, site : http://www.leica-micro-systems.com), reprend le principe précédent d’un prélè-vement sans contact direct tout en appliquant certaines
modi� cations sur le mode de récupération du matériel biologique. Le travail est effectué avec un microscope droit et la zone découpée par un laser UV est récupérée par gravité dans le capuchon d’un tube placé en dessous de la lame histologique. Dans ce système, à l’instar des autres, c’est le faisceau laser qui se déplace sur la zone à découper alors que la coupe tissulaire reste en place sur la platine du microscope (fi gure 4).• Enfin le dernier système, le MMi Cellcut® (site : http://www.molecular-machines.com/products/laser-microdissection.html), proposé en France par Nikon, a été développé pour répondre également à l’ensemble des applications de microdissection. Le système fonctionne également avec un laser UV diode (λ = 335 nm) et se com-pose d’un microscope inversé. Le principe de ce système est lié à l’utilisation de tubes de récupération (Isolation Cap®) dont la particularité est de présenter une partie adhésive emplissant le capuchon (fi gure 5). La coupe histologique est déposée sur une � ne membrane insérée au centre d’une lame de verre ou de métal. Après coloration si nécessaire,
Figure 2 – Système LMC Arcturus.
a. Pose de la capsule au contact de la coupe histologique.b. Déclenchement du laser IR et adhésion de la membrane thermosensible sous l’impulsion du laser (Copyright by http://www.alphelys.com).
Figure 3 – Système LMPC PALM.
Catapultage d’une région tissulaire d’intérêt sélectionnée vers le capuchon d’un tube classique contenant quelques µL d’une solution appropriée à l’analyse moléculaire souhaitée (étude génomique, transcriptomique ou protéomique) (Copyright by http://www.zeiss.com).
60 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418
Dossier scientifi que
le capuchon d’un de ces tubes va ensuite être mis en contact au recto de cette membrane (donc à l’opposé de la surface sur laquelle se trouve la coupe histologique). La zone d’intérêt est virtuellement délimitée, puis découpée par le laser avant d’écarter mécaniquement le tube de la membrane : les régions ou cellules alors précédemment sélectionnées restent ainsi � xées sur le capuchon et peu-vent être ensuite analysées après solubilisation dans une solution appropriée.
2. Les applications (fi gure 6)
L’utilisation de la microdissection tissulaire dans le cadre d’un protocole d’étude d’une pathologie tumorale répond initialement à un seul objectif qui est celui d’enrichir le maté-riel d’étude en cellules phénotypiquement identiques, tout en faisant abstraction ou en détruisant les cellules d’une autre nature. Cette technique contribue à augmenter la sen-sibilité et la spéci� cité des analyses ultérieures de biologie moléculaire et peut alors permettre de comparer avec une
plus grande précision des zones différentes au sein d’une même tumeur, comme par exemple entre la composante intra-canalaire et la composante in� ltrante d’un cancer du sein [8], ou bien de comparer des populations cellulaires différentes à partir d’un même prélèvement, comme par exemple entre cellules tumorales et cellules normales du tissu péritumoral dans le cancer du côlon [9].La pathologie tumorale représente aujourd’hui le principal champ d’application de cette technique de sélection tis-sulaire mais d’autres domaines se sont progressivement ouverts à ces nouvelles approches méthodologiques com-me la culture cellulaire [10] et la fécondation in vitro [11].
2.1. La génomiqueLe génome tumoral reste la principale cible des études uti-lisant la technique de microdissection tissulaire. À partir de fragments cellulaires obtenus par microdissection, une des applications les plus répandues de cette technique est la recherche de pertes d’hétérozygotie (en anglais, LOH pour loss of heterozygosity) dans de nombreuses tumeurs can-céreuses en comparant les individus. Ce type d’étude est facilité par l’existence à l’état normal d’un polymorphisme de certaines régions du génome, c’est-à-dire de segments d’ADN qui peuvent être différents sur le chromosome maternel et le chromosome paternel d’un même individu. Ainsi nous avons montré que la microdissection tissulaire augmentait très nettement la sensibilité de détection des LOH pour lesquelles un tiers n’étaient pas reconnues utilisant du tissu tumoral total, sans microdissection [12].Sans être exhaustif, l’application de cette technologie a porté notamment sur le cancer du poumon [13], du côlon [14], du poumon [13] ou de la prostate [15].Il est également possible de rechercher des modi� cations des séquences microsatellites [16], de mettre en évidence des mutations ponctuelles [17], de démontrer la clonalité d’une population tumorale ou de réarrangements possibles des gènes dont la mise en évidence peut représenter un élément important dans la caractérisation d’une prolifé-ration cellulaire [18].Dans le domaine de la cytogénétique classique, pour permettre la recherche d’anomalies génomiques, la tech-nique d’hybridation génomique comparative (ou CGH-array, pour comparative genomic hybridization array) a contribué à la mise en évidence de remaniements grâce à l’utilisation de puces à ADN qui permettent une analyse hautement résolutive d’un grand nombre de fragments d’ADN du génome [19]. Cette méthode rapide, sensible et automatisable, permet de tester par hybridation compé-titive un nombre très élevé de régions du génome. Outre de comparer le génome de deux populations de cellules (l’une saine et l’autre cancéreuse par exemple), ou encore de faire l’inventaire des gènes exprimés dans un tissu donné, l’utilisation des puces facilite le traitement simul-tané de nombreux échantillons par rapport aux méthodes classiques d’hybridation. Cette technique, couplée à la microdissection laser, a notamment permis de détecter des SNP (single nucleotide polymorphism), un type de polymorphisme de l’ADN dans lequel deux chromosomes diffèrent sur un segment donné par une seule paire de bases [20]. Une puce pouvant contenir plusieurs dizaines de milliers de sondes, l’ADN d’un individu est fragmenté et
Figure 4 – Système LMD de Leica.
Découpage d’une région tissulaire d’intérêt sélectionnée, et récupération par gravité vers le capuchon d’un tube classique positionné sous la coupe tissulaire (Copyright by http://www.leica-microsystems.com).
Figure 5 – Système Cell Cut de MMI.
Partie adhésive du capuchon d’un tube (� èche) permettant la récupération d’unerégion tissulaire d’intérêt qui a été sélectionnée au préalable puis découpée par le faisceau laser avant séparation de la lame histologique et du capuchon (Copyright by http://www.molecular-machines.com).
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418 // 61
ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES
marqué avec un � uorochrome puis hybridé avec l’ADN � xé sur la puce. Seuls les fragments qui trouvent la séquence exactement complémentaire sont retenus. Après lavage pour éliminer l’ADN � uorescent en excès, on analyse les oligonucléotides qui ont retenu de la � uorescence, ce qui permet de déterminer quelle est la séquence exacte pour le gène correspondant.La microdissection chromosomique représente une des approches possibles jusqu’à l’isolement d’un gène délé-tère [21], mais cela nécessite l’obtention préalable d’un certain nombre de marqueurs ou sondes d’ADN de la région impliquée. Elle permet ainsi de constituer une banque d’ADN à partir de fragments chromosomiques microdisséqués assu-rant un degré supplémentaire de puri� cation des séquences spéci� ques d’intérêt. La caractérisation de ces fragments ou bandes chromosomiques combine la technique de récupération par microdissection avec la technique de FISH (microFISH, fl uorescent in situ hybridization) [22].
2.2. La transcriptomiqueDes études du transcriptome (ensemble des ARN cellu-laires) des cellules tumorales ont pu être réalisées à partir de microdissection de tissus congelés grâce au dévelop-pement de techniques d’analyse plus récentes comme la RT-PCR quantitative en temps réel [23]. En général, après une étape d’ampli� cation, les ARN totaux ainsi obtenus servent à synthétiser des ADN complémentaires en vue d’une analyse par micro-array [24].
Cependant, la qualité et l’intégrité des ARN extraits, classi-quement évaluée par la mesure du ratio d’absorbance optique A260/A280 et par électrophorèse sur gel d’agarose, restent le problème majeur de cette technique. La société Agilent Technologies (site : http://www.agilent.com/chem/RIN) a développé un logiciel informatique qui à partir de très petites quantités d’ARN assigne ainsi un indice de qualité de ces ARN extraits, appelé RIN (pour, RNA integrity number), selon leur pro� l de migration électrophorétique. Cet indice s’échelonne de la valeur 1 (ARN complètement dégradé) à la valeur 10 (ARN d’excellente qualité). Seuls en général les indices au moins égaux à la valeur 8 avec un ratio A260/A280 supérieur à 1,8 sont pris en considération pour une étude d’ARN faite par la technique du cDNA-microarray. La quanti� cation des ARN totaux extraits, étape certes informative mais qui consomme du matériel au détriment de l’analyse elle-même, se fait dorénavant de plus en plus par dosage spectrométrique utilisant le système Nanodrop (Nanodrop ND-1000, Labtech) qui s’applique parfaitement aux très petites quantités.
2.3. La protéomiqueS’atteler à l’étude de la protéomique c’est parcourir un long chemin face à un système dynamique présentant une grande variabilité en termes de caractéristiques chimiques et de quantité. Une protéine a une masse, une forme, des structures primaire, secondaire, tertiaire et peut-être quaternaire ; elle a une certaine charge à un pH donné,
Figure 6 – Applications de la microdissection laser.
(1) Le prélèvement tissulaire entier est broyé en vue d’extraire les produits dérivés permettant (2) une analyse moléculaire au niveau de la génomique, de la transcriptomique ou de la protéomique.(3) Le prélèvement tissulaire est observé au microscope et peut être analysé par des techniques immunohistochimiques faites sur coupe histologiques.(4) La technique de microdissection laser permet de visualiser et de prélever avec précision sur coupes histologiques les cellules d’intérêt qui vont être étudiées ensuite par des techniques d’analyse moléculaire.
62 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418
Dossier scientifi que
elle présente une certaine densité ; elle possède un cer-tain degré d’hydrophilicité ou d’hydrophobicité. Elle se retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une organelle donnée. De plus, une étude portant sur différents prélèvements tissulaires sera d’autant plus délicate que nous sommes confrontés à la complexité des systèmes cellulaires impliquant que, pour une même surface donnée, le nombre de cellules (dû aux variations de taille) sera différent d’un tissu à l’autre. Il est donc préférable de raisonner quantitativement en volume de tissu (surface de la zone d’intérêt mesurable sur certains appareils x épaisseur de la coupe histologique) plutôt qu’en nombre de cellules. Également, la fraction protéique étant essentiellement cytoplasmique, il faudra parfois tenir compte du rapport nucléo-cytoplasmique variable selon l’état patho-physiologique du prélèvement [25].Il n’y a pas à l’heure actuelle de protocole ubiquitaire établi qui permette l’étude du protéome de prélèvements tissu-laires, quels qu’ils soient. La phase initiale d’une étude se caractérise d’abord par un traitement visant à extraire la ou les protéines d’intérêt présentes dans le tissu prélevé selon des règles assez normalisées (lyse des tissus ou des cellules par sonication ou par choc osmotique ; solu-bilisation optimale de toutes les protéines en utilisant des détergents et en rompant les liaisons covalentes), tout en tenant compte des propriétés physicochimiques de ces protéines et en s’assurant d’une protection ef� cace contre l’activité des protéases (travail à basse température et en présence d’inhibiteurs de protéases).Ensuite plusieurs techniques d’approche peuvent être envisagées, mais la plus courante est représentée par l’utilisation de gel d’électrophorèse de polyacrylamide (PAGE, de l’anglais polyacrylamide gel electrophoresis) pour séparer les différentes protéines en fonction de leur taille. Une analyse « ciblée » des protéines par western-blot [26] peut alors être réalisée à condition de disposer des anticorps adéquats, mais elle nécessite cependant une importante quantité de protéines dont l’obtention est rendue dif� cile à partir de petits fragments tissulaires microdisséqués.
• Le protéome tissulaire peut également être étudié en ayant recours à l’électrophorèse bidimensionnelle (gel-2D), par exemple suivie par une coloration au nitrate d’ar-gent [27, 28], mais cette stratégie d’approche technique assez laborieuse a montré ses limites pour l’analyse de protéines de haut poids moléculaire ou pour celle de protéines ayant un point isoélectrique extrême (pI > 11), ou voire de protéines très hydrophobes. En termes de visualisation des protéines séparées par électropho-rèse 2D, l’utilisation des sondes � uorescentes a permis de quanti� er les protéines avec une plus grande gamme de linéarité. Ces colorations sont à l’origine de nouvel-les avancées dans les études comparatives par gel-2D conduisant à la technique appelée 2D-DIGE (2D-diffe-rence gel electrophoresis) qui utilise le marquage de deux échantillons par deux � uorophores différents (propyl-C3, vert, et méthyl-C5, rouge). Les protéines issues de chacun des deux échantillons à comparer sont séparées sur un même gel-2D. Après excitation à deux longueurs d’onde différentes, ce gel donnera ainsi deux images parfaite-
ment superposables dont les spots pourront ensuite être examinés par spectrométrie de masse [29].
• La spectrométrie de masse est utilisée pour dériver des informations structurales en fragmentant les molé-cules analysées et déterminer les masses de leurs frag-ments ; on parle alors de spectrométrie de masse en mode tandem (ou MS/MS). La spectrométrie de masse est typiquement utilisée en protéomique après une éta-pe de digestion enzymatique des protéines d’intérêt : une enzyme spéci� que (la trypsine) coupe les protéines en des positions particulières de leur séquence (après les acides aminés basiques), et produit un mélange complexe de peptides (petits fragments de protéines). A� n de gérer la complexité de ces échantillons, les mélanges de peptides sont séparés par nano-chromatographie liquide (nanoLC) avant leur injection dans la source du spectromètre de masse. Pour chaque peptide, les ana-lyses MS/MS permettent d’accéder à la mesure de sa masse et à celle de fragments. Les données ainsi col-lectées sont soumises à une analyse informatisée avec interrogation des banques de données protéiques, via l’Internet (voir par exemple ExPASy proteomics server - Expert Protein Analysis System, site : http://www.expasy.org), conduisant vers une possible identi� cation de la protéine à partir de sa séquence en acides aminés si elle est référencée. On distingue plusieurs systèmes de spectrométrie de masse dont le système MALDI-ToF (pour matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of fl ight) constitue une méthode simple et robuste pour l’analyse des masses. Le principe général repose sur une ionisation du matériel protéique/peptidique à l’aide d’un laser et au déplacement (mesuré en temps de vol) de ce matériel chargé vers un détecteur [30]. Le SELDI-ToF (pour surface-enhanced laser desorption/ioni-zation, à l’origine proposé par Ciphergen Biotechnologies Inc., et repris par Bio-Rad : http//www3.bio-rad.com/, sous le nom de ProteinChip Seldi System), une autre tech-nologie découlant de la précédente, repose sur l’utilisation de « chips » ou barrettes qui comportent des sites actifs constitués de surfaces chimiques (covalentes, ioniques, hydrophobes, hydrophiles, métaux) ou biochimiques (anti-corps, récepteur, ADN) permettant la rétention spéci� que de certaines protéines/peptides d’intérêt par af� nité selon les propriétés physico-chimiques qui les caractérisent [31]. Mais cela nécessite au préalable une connaissance des propriétés propres à la famille à laquelle appartient la pro-téine recherchée.
• Une stratégie innovante, appelée « accurate mass and time tags » ou « AMT », a récemment démontré un fort potentiel en recherche protéomique, avec en particulier un débit d’analyse élevé, ce qui rend possible la gestion d’analyses protéomiques quantitatives sur de grands nombres d’échantillons et avec une grande sensibilité [32]. Elle permet l’identi� cation de peptides sur la base de leur temps de rétention chromatographique et de leur masse déterminée de façon précise grâce à l’utilisation d’un spectromètre de masse à résonance cyclotronique et transformée de Fourier [33]. Ainsi, à partir d’un échantillon de 5 000 cellules tumorales de cancer du sein obtenues
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418 // 63
ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES
par la technique de microdissection laser, soit l’équivalent de 500 ng de protéines totales, cette technologie a permis non seulement d’identi� er un millier de protéines uniques couvrant une large variété de fonctions biologiques et de compartiments cellulaires, mais aussi de mettre en évidence certaines d’entre elles comme une signature associée à la résistance au tamoxifen dans la récidive du cancer du sein [34]. Ces travaux ont pu démontrer qu’à partir d’un nombre limité de cellules et en utilisant la méthode AMT, il était possible de détecter et d’identi� er un nombre subs-tantiel de protéines et ainsi d’atteindre les profondeurs du protéome, tout en permettant un débit d’analyse élevé. La protéomique représentant une discipline en rapide évolution, on notera en particulier les récents progrès de l’instrumentation en spectrométrie de masse (par exemple, LTQ Orbitrap XL) et en nanoLC dont les performances pour les études protéomiques d’échantillons microdisséqués doivent répondre à une triple exigence : gain de sensibilité (à partir de quelques atomoles de matériel), gain en infor-mation (identi� cation de milliers de peptides correspondant à plusieurs centaines de protéines en une seule analyse LC-MS/MS) et gain de temps (possibilité d’analyser les peptides résultant de la digestion trypsique d’un mélange très complexe de protéines sans séparation électropho-rétique préalable). Ce type de con� guration instrumentale représente à l’heure actuelle un outil puissant pour l’analyse des échantillons complexes de protéines [35].
• Le développement d’une technique comme la reverse phase protein (micro)array (RPPA) représente une autre voie d’analyse intéressante. Le principe se caractérise par des dépôts simultanés d’une faible quantité de protéines tota-les (de l’ordre du picogramme au femtogramme) retenue sous forme de spot par adsorption sur une membrane de nitrocellulose, jusqu’à l’équivalent de 200 cellules dépo-sées par spot sur une lame. Plusieurs spots constitués d’échantillons protéiques re� étant différents stades ou états physiologiques peuvent ainsi être déposés sur les-quels sera testé un anticorps spéci� que [36].
L’étude de la protéomique ne béné� cie pas de l’énorme avancée technologique que l’on a pu observer pour celle des acides nucléiques grâce à laquelle une molécule d’ADN ou d’ARN peut être ampli� ée des millions de fois par PCR ou RT-PCR. Dans ce sens, il n’y a pas d’ampli� cation pos-sible des protéines extraites d’un prélèvement tissulaire ce qui impacte l’analyse protéomique dans son ensemble, notamment lorsqu’il s’agit de prélèvements tissulaires de petite taille. Un problème majeur des techniques protéo-miques conventionnelles reste cependant celui d’obtenir une quantité suf� sante de protéines à analyser et donc de passer plus de temps lors de la récupération par micro-dissection, ce qui va accroître le risque d’altération de leur qualité. Pour le patient, la vraie � nalité de ces techniques protéomiques est de voir émerger des marqueurs molé-culaires pronostiques ou prédictifs de l’atteinte d’un tissu ou d’une pathologie comme cela a été décrit par exemple pour le cancer de la prostate [37]. De telles données portant sur l’analyse du niveau d’expression de ces marqueurs et de leur état fonctionnel ou non pourraient permettre d’en-visager des thérapies ciblées en réponse à l’agressivité de
certains cancers. L’étude de la protéomique est en plein développement et commence à devenir compatible avec les contraintes de la recherche clinique, la microdissection laser représentant l’outil incontournable.
3. Précautions d’analyse
Le résultat des analyses moléculaires après microdis-section sera fonction non seulement du type tissulaire lui-même mais surtout de la qualité et de la préparation des échantillons.Les coupes de tissu, congelé ou � xé puis inclus en paraf� ne, ne devront être ni trop épaisses, ce qui gênerait l’observa-tion microscopique, ni trop � nes, ce qui réduirait d’autant la quantité de matériel obtenu. En pratique, la majorité des équipes utilise des coupes de 7 à 10 microns d’épaisseur. Il est à noter que l’observation morphologique peut néces-siter un certain temps d’adaptation à la reconnaissance parfaite des cellules du fait de l’absence de lamelle et de milieu de montage sur la coupe tissulaire. Il est alors par-fois recommandé de préparer simultanément une coupe sériée colorée mise entre lame et lamelle pour faciliter l’identi� cation des zones ou cellules d’intérêt.En pratique, le bon déroulement d’un protocole doit tenir compte des exigences des techniques de biologie molé-culaire qui seront appliquées in fi ne au matériel prélevé par microdissection tout en permettant une bonne observation morphologique des tissus étudiés. L’idéal est de disposer de matériel tissulaire congelé qui assure une meilleure qualité de préservation tissulaire des produits dérivés permettant d’accroître la sensibilité aux techniques d’analyses molé-culaires. Bien qu’il soit cependant envisageable d’étudier et d’analyser les échantillons à partir de prélèvements tissulaires préalablement � xés puis inclus en paraf� ne, il faut considérer que tous traitements appliqués aux tissus peuvent modi� er, voire altérer les molécules biologiques et déstabiliser un grand nombre d’interactions et de struc-tures moléculaires.
3.1. Le prélèvement et le conditionnementA� n de pouvoir être utilisables, les échantillons doivent répondre à des exigences de qualité, de quantité et être convenablement annotés pour permettre une bonne tra-çabilité. Il est indispensable de travailler avec des gants (pour ne pas introduire de RNases, ni de kératines dans les milieux réactionnels) en utilisant des instruments réservés à cet usage (rasoirs, pinces,…), correctement nettoyés et stérilisés de manière à éviter les contaminations, voire de matériel stérile à usage unique. Les lames histologi-ques doivent être propres et traitées préalablement par une solution de diéthylpyrocarbonate (DEPC en solution à 0,1 % dans de l’eau) avant stérilisation pour limiter la dégradation de l’ARN. Il doit en être de même des solu-tions utilisées tout au long d’un protocole qui auront été préparées avec une eau stérile également traitée avant d’être autoclavées.
3.1.1. Tissus congelésLe prélèvement initial est essentiel. Un mauvais condi-tionnement du prélèvement peut en effet entraîner des résultats faussés. Ainsi, l’in� uence du temps d’ischémie
64 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418
Dossier scientifi que
chaude (temps écoulé, entre le clampage vasculaire et l’excision, au cours duquel la vascularisation d’un organe est interrompue) a été montrée expérimentalement sur la dégradation des ARN observée dans une étude faite chez le rat par Lazarus [38]. Cette étude faite à 37 °C pendant 60 minutes a permis de montrer qu’un temps d’ischémie chaude supérieur à 30 minutes entraînait une dégradation d’une partie des ARN dans les tissus de la pièce opéra-toire. L’ischémie chaude, qui entraîne la nécrose cellulaire rapide, est une période très mal tolérée qui ne doit pas dépasser quelques minutes. La protection des organes contre les lésions dues à l’ischémie chaude repose sur la réfrigération. Outre le fait qu’il a été constaté une baisse de 50 % des ARN de haut poids moléculaire dans les reins maintenus une heure en ischémie chaude, il est également prudent d’éviter tout contact du tissu avec un composant chimique utilisé pour congeler les tissus comme l’isopentane ou par exemple l’OCT (pour optimal cutting temperature, aussi appelé Tissue-Tek® embedding medium, Sakura Finetek, Inc., Torrance, CA, États-Unis) qui a été décrit comme pouvant interférer sur l’analyse moléculaire [39]. L’idéal reste une congélation rapide par de l’azote liquide en immersion totale sans contact direct des échantillons autre que les vapeurs au travers d’un cryotube dans lequel ils ont été placés dans des condi-tions stériles (en condition RNase-free), puis stockés à - 80 °C en congélateur sous surveillance a� n de ne pas rompre la chaîne du froid. A� n d’éviter la dégradation des ARN par l’activation des nucléases tissulaires présentes en quantité variable d’un tissu à l’autre, la chaîne du froid doit être maintenue jusqu’à la préparation des coupes au cryostat. De fait, les coupes doivent être bien déshydra-tées et la microdissection doit être réalisée rapidement, dans une échelle de temps allant de 15 à 20 minutes par coupe histologique, avant que l’activation des RNases tissulaires maintenues à température ambiante pendant la microdissection ne dégrade trop les ARN.
3.1.2. Tissus � xésUne étape de � xation tissulaire représente le passage obligé pour pouvoir correctement couper les tissus non congelés destinés à être ensuite inclus en paraf� ne. Elle doit être rapide pour éviter l’altération des acides nucléiques et des protéines, et comprise entre 2 et 12 heures pour des petits fragments. Une sur� xation risque de diminuer le rendement de l’extraction des acides nucléiques [40]. Le � xateur le plus répandu reste encore le formol ou un de ses dérivés, mais celui-ci peut induire des agrégations entre protéines par formation de base de Schiff et de pont méthylène [41]. De plus, ce produit instable, pouvant se transformer en acide formique, implique que son pH soit tamponné avant utilisation [42]. Bien qu’employé massi-vement dans les laboratoires de pathologie et d’histologie humaine ou animale, le formol et ses variantes aldéhydiques présentent un autre inconvénient majeur de par sa haute toxicité. Classé cancérogène de classe I depuis l’arrêté du 13 juillet 2006 portant sur la liste des substances, prépa-rations et procédés cancérogènes dans l’article R. 231-56 du Code du travail, sur la base d’études épidémiologiques du CIRC (Centre international de recherche sur le cancer), il est démontré à l’origine de pathologies respiratoires
et de cancers des voies respiratoires [43], et est donc interdit d’utilisation en France sans précautions préala-bles. De fait, cette obligation a orienté les laboratoires vers l’emploi d’autres types de � xateurs essentiellement alcooliques, dont certains font encore l’objet d’évaluation, ne contenant plus de produits à base de formaldéhyde. Parmi certains de ces � xateurs moins toxiques récemment disponibles sur le marché [44-47], le RCL2®, développé depuis 1999 initialement dans le Centre de lutte contre le cancer Claudius-Regaud (Toulouse, France, site : http://www.claudiusregaud.fr), semble connaître un plus grand succès préservant à la fois les structures tissulaires et cellulaires et restant compatible avec la biologie molécu-laire [48]. Néanmoins, il faut toutefois garder à l’esprit qu’il existe probablement d’autres toxicités sous-jacentes dans l’utilisation faite actuellement de ces nouveaux � xateurs mais non encore démontrées du fait d’un manque de recul en pratique quotidienne.S’il est tout à fait possible d’extraire de l’ADN à partir de prélèvements tissulaires inclus en paraf� ne, il est éga-lement envisageable d’étudier des protéines, mais les traitements appliqués aux tissus peuvent grandement altérer les structures protéiques. En effet, l’étape d’inclu-sion proprement dite, impliquant l’utilisation de paraf� ne chauffée à 56 °C sur une période d’une dizaine d’heures pour permettre une imprégnation correcte des tissus, risque de perturber la réactivité immunohistochimique de certaines protéines [49].En� n, il reste à noter que le liquide de Bouin aqueux ou alcoolique, qui permet une bonne analyse morphologique et peut être utilisé pour l’immunohistochimie, est très fortement déconseillé pour les techniques de biologie moléculaire [50]. Et, bien que décrite dans la littérature pour certaines applications, l’étude des ARN à partir de tissu � xé est généralement à éviter.
3.2. La coloration histologique avant microdissectionL’étape suivante, permettant l’identi� cation de différentes cellules ou de zones tissulaires, est la coloration des coupes histologiques déposées sur lames de verre. De nouveau, des interactions ou dégradations peuvent intervenir selon le colorant qui va être employé. Classiquement, l’héma-toxyline est utilisée avec l’éosine, mais cette dernière seule peut se révéler d’un grand intérêt de part sa capacité à être � uorescente. Il n’y a en fait pas de règle stricte quant à l’utilisation de tel ou tel colorant ou d’immunomarquage. C’est souvent l’expérience et/ou une mise au point préa-lable par des tests qui guideront l’expérimentateur. Ainsi divers colorants courants ont été employés, restant à l’appréciation de l’utilisateur, comme par exemple le bleu de toluidine [51] ou le vert de Méthyle [52], tout en précisant qu’une identi� cation des cellules ou zones tissulaire sans coloration est préférable. À cet effet, certains fabricants de microdissecteur (système Navigator® sur le système LMPC de PALM, notamment) ont imaginé un système de repérage informatisé au travers duquel, à partir de coupes histologiques sériées, une coupe est colorée entre lame et lamelle et sert de référence pour les autres lames qui, non colorées, seront microdisséquées. Dans quelques cas, notamment pour des tissus riches en protéases, il
REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418 // 65
ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES
Références[1] Bertheau P, Meignin V, Janin A. [Microdissection on histologic and cytologic preparation: an approach to tissue heterogeneity]. Ann Pathol 1998;18(2):110-9.
[3] Zhuang Z, Bertheau P, Emmert-Buck MR, et al. A microdissec-tion technique for archival DNA analysis of speci� c cell populations in lesions < 1 mm in size. Am J Pathol 1995;146(3):620-5.
[4] Gupta SK, Douglas-Jones AG, Morgan JM. Microdissection of stained archival tissue. Mol Pathol 1997;50(4):218-20.
[5] d’Amore F, Stribley JA, Ohno T, et al. Molecular studies on single cells harvested by micromanipulation from archival tissue sections previously stained by immunohistochemistry or nonisotopic in situ hybridization. Lab Invest 1997;76(2):219-24.
[6] Emmert-Buck MR, Bonner RF, Smith PD et al. Laser capture micro-dissection. Science 1996;274(5289):998-1001.
[7] Schutze K, Lahr G. Identi� cation of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nat Biotechnol 1998;16(8):737-42.
[8] Zhu G, Reynolds L, Crnogorac-Jurcevic T et al. Combination of microdissection and microarray analysis to identify gene expression changes between differentially located tumour cells in breast cancer. Oncogene 2003;22(24):3742-8.
[9] Sugiyama Y, Farrow B, Murillo C, et al. Analysis of differential gene expression patterns in colon cancer and cancer stroma using microdis-sected tissues. Gastroenterology 2005;128(2):480-6.
[10] Stich M, Thalhammer S, Burgemeister R, et al. Live cell catapulting and recultivation. Pathol Res Pract 2003;199(6):405-9.
[11] Clement-Sengewald A, Buchholz T, Schutze K, et al. Noncontact, laser-mediated extraction of polar bodies for prefertilization genetic diagnosis. J Assist Reprod Genet 2002;19(4):183-94.
[12] Bertheau P, Plassa LF, Lerebours F, et al. Allelic loss detection in in� ammatory breast cancer: improvement with laser microdissection. Lab Invest 2001;81(10):1397-402.
[13] Mead LJ, Gillespie MT, Hung JY, et al. Frequent loss of heterozygo-sity in early non-small cell lung cancers at chromosome 9p21 proximal to the CDKN2a gene. Int J Cancer 1997;71(2):213-7.
[14] Zhuang Z, Emmert-Buck MR, Roth MJ, et al. von Hippel-Lindau disease gene deletion detected in microdissected sporadic human colon carcinoma specimens. Hum Pathol 1996;27(2):152-6.
[15] Vocke CD, Pozzatti RO, Bostwick DG ,et al. Analysis of 99 micro-dissected prostate carcinomas reveals a high frequency of allelic loss on chromosome 8p12-21. Cancer Res 1996;56(10):2411-6.
[16] Giuffre G, Muller A, Brodegger T, et al. Microsatellite analysis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer-associated colorectal adeno-mas by laser-assisted microdissection: correlation with mismatch repair protein expression provides new insights in early steps of tumorigene-sis. J Mol Diagn 2005;7(2):160-70.
[17] Coulbault L, Herlicoviez D, Chapon F, et al. A novel mutation in the mitochondrial tRNA Asn gene associated with a lethal disease. Biochem Biophys Res Commun 2005;329(3):1152-4.
[18] McCarthy RP, Zhang S, Bostwick DG, et al. Molecular genetic evi-dence for different clonal origins of epithelial and stromal components of phyllodes tumor of the prostate. Am J Pathol 2004;165(4):1395-400.
[19] Morandi L, Marucci G, Foschini MP, et al. Genetic similarities and differences between lobular in situ neoplasia (LN) and invasive lobular carcinoma of the breast. Virchows Arch 2006;449(1):14-23.
peut être conseillé d’ajouter à la solution de colorant un mélange d’inhibiteurs de protéases tels ceux disponibles chez certains fournisseurs de réactifs biologiques.
4. Conclusion et conseils utiles
De nombreux critères doivent être pris en compte dans la démarche d’analyse moléculaire d’un prélèvement tissulaire microdisséqué, mais il faudra aussi considérer que chaque étape vous approchant de la puri� cation de votre matériel risquera également de vous en faire perdre des quantités importantes. Il est donc recommandé de minimiser le nombre d’étapes pour en optimiser le résultat escompté : obtenir une quantité suf� sante d’échantillons analysables et éventuellement mesurables par les techniques classiques à partir de tissus morphologiquement identi� ables.Dans des prélèvements tissulaires, nous sommes confrontés à un problème qui constitue le facteur limitant dans l’étude de la protéomique : l’aspect quantitatif du matériel récupéré qui nécessite d’augmenter le nombre de cellules prélevées. Cela implique donc de passer beaucoup plus de temps lors de la microdissection de certains tissus entraînant un risque d’altération de la qualité du matériel récupéré. Ceci est encore plus valable pour l’analyse des ARN si aucune information n’est connue, tant sur le nombre de copie que sur le temps de demi-vie du transcrit étudié.Il reste incontournable en premier lieu de développer une méthode assurant la qualité initiale du prélèvement tout au long des différentes étapes du traitement tissulaire en considérant que l’approche technique sera essentiellement fonction du tissu étudié, de sa texture et notamment par la
présence ou non de nucléases ou de protéases, de l’état de ce tissus (congelé ou inclus en paraf� ne après � xation) et de l’étude envisagée pouvant porter sur l’ADN, l’ARN et les protéines.En conclusion la technique de microdissection tissulaire assistée par laser présente donc des avantages indénia-bles corroborés par de nombreuses publications montrant notamment une grande précision dans le prélèvement, pouvant aller jusqu’au prélèvement monocellulaire, et même au niveau de bande chromosomique. Elle a également l’avantage de minimiser les risques de contamination en assurant un excellent contrôle du recueil du matériel pré-levé. Il n’en demeure pas moins cependant que le coût de l’investissement pour l’acquisition d’un tel système reste encore aujourd’hui élevé, auquel peuvent s’ajouter des frais importants en ce qui concerne les consommables (lames histologiques spéciales, capsules et tubes de récu-pération) et la mise à jour des logiciels. Il est important de souligner que l’utilisation d’une telle technologie, pour de nombreuses raisons évoquées jusqu’ici, ne peut être pour l’instant mise en place dans un contexte de suivi clinique de routine, mais s’applique en revanche parfaitement à des protocoles de recherche bien dé� nis dans le cadre d’une plateforme multi partenariale. Il faut alors bien garder à l’esprit qu’un encadrement technique à long terme est impératif aussi bien pour la maintenance technique du sys-tème et la pérennité des protocoles développés et à venir, que pour des formations spécialisées pouvant s’adresser aux chercheurs, techniciens, ingénieurs et étudiants.
Confl it d’intérêt : aucun
66 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - JANVIER 2010 - N°418
Dossier scientifi que
[20] Harada T, Chelala C, Bhakta V, et al. Genome-wide DNA copy num-ber analysis in pancreatic cancer using high-density single nucleotide polymorphism arrays. Oncogene 2008;27(13):1951-60.[21] Hu L, Sham JS, Tjia WM, et al. Generation of a complete set of human telomeric band painting probes by chromosome microdissec-tion. Genomics 2004;83(2):298-302.[22] Meltzer PS, Guan XY, Burgess A, et al. Rapid generation of region speci� c probes by chromosome microdissection and their application. Nat Genet 1992;1(1):24-8.[23] Zhao WL, Mourah S, Mounier N, et al. Vascular endothelial growth factor-A is expressed both on lymphoma cells and endothelial cells in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related to lymphoma progres-sion. Lab Invest 2004;84(11):1512-9.[24] Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T, et al. Alterations of gene expres-sion during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithe-lia. Cancer Res 2001;61(9):3544-9.[25] Rudzki Z, Szczudrawa J, Stachura J. Morphometry of normal, regenerating and cancerous hepatocytes. Folia Histochem Cytobiol 1989;27(3):141-8.[26] Zhang DH, Tai LK, Wong LL, et al. Proteomics of breast cancer: enhanced expression of cytokeratin19 in human epidermal growth factor receptor type 2 positive breast tumors. Proteomics 2005;5(7):1797-805.[27] Banks RE, Dunn MJ, Hochstrasser DF, et al. Proteomics: new perspec-tives, new biomedical opportunities. Lancet 2000;356(9243):1749-56.[28] McGregor E, De Souza A. Proteomics and laser microdissection. Methods Mol Biol 2006;333(291-304.[29] Greengauz-Roberts O, Stoppler H, Nomura S, et al. Saturation labe-ling with cysteine-reactive cyanine � uorescent dyes provides increased sensitivity for protein expression pro� ling of laser-microdissected clini-cal specimens. Proteomics 2005;5(7):1746-57.[30] Mouledous L, Hunt S, Harcourt R, et al. Proteomic analysis of immu-nostained, laser-capture microdissected brain samples. Electrophoresis 2003;24(1-2):296-302.[31] von Eggeling F, Davies H, Lomas L, et al. Tissue-speci� c micro-dissection coupled with ProteinChip array technologies: applications in cancer research. Biotechniques 2000;29(5):1066-70.[32] Shen Y, Tolic N, Masselon C, et al. Nanoscale proteomics. Anal Bioanal Chem 2004;378(4):1037-45.[33] Page JS, Masselon CD, Smith RD. FTICR mass spectrometry for qualitative and quantitative bioanalyses. Curr Opin Biotechnol 2004;15(1):3-11.[34] Umar A, Kang H, Timmermans AM, et al. Identi� cation of a putative protein pro� le associated with tamoxifen therapy resistance in breast cancer. Mol Cell Proteomics 2009;8(6):1278-94.[35] Baker H, Patel V, Molinolo AA, et al. Proteome-wide analysis of head and neck squamous cell carcinomas using laser-capture microdis-section and tandem mass spectrometry. Oral Oncol 2005;41(2):183-99.[36] Tibes R, Qiu Y, Lu Y, et al. Reverse phase protein array: valida-tion of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary
leukemia specimens and hematopoietic stem cells. Mol Cancer Ther 2006;5(10):2512-21.[37] Wellmann A, Wollscheid V, Lu H, et al. Analysis of microdissec-ted prostate tissue with ProteinChip arrays--a way to new insights into carcinogenesis and to diagnostic tools. Int J Mol Med 2002;9(4):341-7.[38] Lazarus HM. Alterations of high molecular weight nuclear RNA fol-lowing kidney storage. Exp Mol Pathol 1974;21(2):155-65.[39] Turbett GR, Sellner LN. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit ampli� cation by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol 1997;6(5):298-303.[40] Macabeo-Ong M, Ginzinger DG, Dekker N, et al. Effect of duration of � xation on quantitative reverse transcription polymerase chain reac-tion analyses. Mod Pathol 2002;15(9):979-87.[41] Metz B, Kersten GF, Hoogerhout P, et al. Identi� cation of formalde-hyde-induced modi� cations in proteins: reactions with model peptides. J Biol Chem 2004;279(8):6235-43.[42] Plenat F, Montagne K, Weinbreck N, et al. [Molecular consequences of � xation and tissue processing: the examples of nucleic acids and proteins]. Ann Pathol 2006;26(1):8-21.[43] Speit G, Schmid O, Neuss S, et al. Genotoxic effects of formal-dehyde in the human lung cell line A549 and in primary human nasal epithelial cells. Environ Mol Mutagen 2008;49(4):300-7.[44] Stanta G, Mucelli SP, Petrera F, et al. A novel � xative improves opportunities of nucleic acids and proteomic analysis in human archi-ve’s tissues. Diagn Mol Pathol 2006;15(2):115-23.[45] Umlas J, Tulecke M. The effects of glyoxal � xation on the histologi-cal evaluation of breast specimens. Hum Pathol 2004;35(9):1058-62.[46] Vincek V, Nassiri M, Nadji M, et al. A tissue � xative that protects macromolecules (DNA, RNA, and protein) and histomorphology in clini-cal samples. Lab Invest 2003;83(10):1427-35.[47] Olert J, Wiedorn KH, Goldmann T, et al. HOPE � xation: a novel � xing method and paraf� n-embedding technique for human soft tis-sues. Pathol Res Pract 2001;197(12):823-6.[48] Delfour C, Roger P, Bret C, et al. RCL2, a new � xative, preser-ves morphology and nucleic acid integrity in paraf� n-embedded breast carcinoma and microdissected breast tumor cells. J Mol Diagn 2006;8(2):157-69.[49] Bertheau P, Cazals-Hatem D, Meignin V, et al. Variability of immu-nohistochemical reactivity on stored paraf� n slides. J Clin Pathol 1998;51(5):370-4.[50] Ben-Ezra J, Johnson DA, Rossi J, et al. Effect of � xation on the ampli� cation of nucleic acids from paraf� n-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem 1991;39(3):351-4.[51] Kirana C, Ward T, Jordan TW, et al. Compatibility of toluidine blue with laser microdissection and saturation labeling DIGE. Proteomics 2009;9(2):485-90.[52] Okuducu AF, Janzen V, Hahne JC, et al. In� uence of histochemi-cal stains on quantitative gene expression analysis after laser-assisted microdissection. Int J Mol Med 2003;11(4):449-53.
