Modul Kromatografi

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam

teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak

yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan

ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903,

mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom

yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk

melukiskan daerah-daerah yang berwarna bergerak kebawah kolom. Pada waktu

yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk

memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai

penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Perkembangan tentang kromatografi digunakan suatu teknik dalam bentuk

kromatografi padatan cair (LSC). Akhir tahun 1930 an sampai tahun 1940 an,

kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) pada tahun

1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun

1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941, tidak

hanya mengubah kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk

pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin

dan James mempublikasikan kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun

1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar.

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair

Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High

Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) berhasil dikembangkan. Saat ini

dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat, KCKT mencapai suatu

keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

Kromatografi berkembang menjadi teknik pemisahan untuk zat kimiawi dengan sifat

yang sangat mirip, dan dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dan penetapan


kuantitatif untuk zat-zat yang sudah dipisahkan. Keuntungan-keuntungan dari

Kromatografi diantaranya :

1. Kromatografi merupakan metoda pemisahan yang cepat, mudah dan

menggunakan peralatan yang murah serta sederhana, kecuali untuk

kromatografi gas, hingga campuran yang kompleks dapat dipisahkan

dengan mudah.

2. Kromatografi hanya membutuhkan campuran cuplikan .yang sangat

sedikit sekali, bahkan tidak menggunakan jumlah yang besar,

disamping itu kromatografi pekerjaannya dapat diulang.

B. Tujuan :

Adanya modul ini diharapkan peserta diklat dapat melakukan analisis kromatografi

C. Ruang Lingkup

Modul melakukan analisis kromatografi meliputi : menjelaskan dasar-dasar analisis

kromatografi, menyiapkan sampel dan standar, melaksanakan pemisahan

kromatografi, melaksanakan pengukuran analisis, melaksanakan perhitungan hasil

analisis.


BAB II RANCANG BANGUN PEMBELAJARAN MATA DIKLAT/GBPP/SILABUS

Nama Diklat : Pengingkatan Kompetensi Guru Bidang Produktif

Kimia Analis

Mata Diklat : Melakukan Analisis Kromatografi

Jenjang Diklat : Tingkat Menengah

Kode Kompetensi : TR.TK.KA.052.M.1

Alokasi Waktu : 14 X 45 Menit

Tujuan : Peserta diklat diharapkan mampu melakukan analisis

kromatografi

Deskripsi Materi : Melakukan analisis kromatografi meliputi materi :

menjelaskan dasar-dasar analisis kromatografi,

menyiapkan sampel dan standar, melaksanakan

pemisahan kromatografi, melaksanakan pengukuran

analisis, melaksanakan perhitungan hasil analisis.

KOMPETENSI

DASAR

MATERI

PEMBELAJARAN

KEGIATAN

PEMBELAJARAN INDIKATOR

PENILAIAN

WAKTU

JAM

SUMBER

BELAJAR

1. Menjelaskan

dasar-dasar

analisis

kromatografi

Prinsip dasar

kromatografi

Kasifikasi

jenis

kromatografi

Sifat

Kromatografi

Mengenal alat

analisis

kromatografi

Menjelaskan

prinsip dasar

kromatografi

Mengklasifikasi

kan jenis

kromatografi

Jenis-jenis kromatografi dikenali Tahap-tahap analisis kromatografi diketahui.

Tes tulis Observasi Laporan

2 Job Sheet Modul Peralatan

praktek SOP di Lab

Kimia.

2. Menyiapkan

sampel dan

standar

Identifikasi

alat dan

bahan analisis

kromatografi

Prefarasi

sampel

analisis

kromatografi

Standarisasi

bahan kimia

(larutan)

Mengidentifikasi

alat dan bahan

analisis

kromatografi

Melakukan

prefarasi

bahan/sampel

Alat dan bahan disiapkan sesuai kebutuhan

Tes tulis Observasi Laporan

2 Job Sheet Modul Peralatan

praktek SOP di Lab

Kimia


KOMPETENSI

DASAR

MATERI

PEMBELAJARAN

KEGIATAN

PEMBELAJARAN INDIKATOR

PENILAIAN

WAKTU

JAM

SUMBER

BELAJAR

3.

Melaksanakan

pemisahan

kromatografi


BAB II KEGIATAN PEMBELAJARAN

A. KEGIATAN PEMBELAJARAN 1. MENJELASKAN DASAR-DASAR ANALISIS KROMATOGRAFI.

1. LEMBAR INFORMASI

1.1. DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

a. Prinsip Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Istilah

kromatografi berasal dari kata “chroma” (warna) dan “graphein”

(menuliskan). Teknik pemisahan analitik yang paling banyak digunakan

ditemukan pada tahun 1903 oleh TSWETT, ia telah menggunakan

kromatografi untuk pemisahan senyawa-senyawa yang berwarna dan

nama kromatografi diambil dari senyawa yang berwarna.

b. Klasifikasi Kromatografi

Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen

dalam fasa diam dan fasa gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen

yang akan dipisahkan.

Kromatografi

Kertas

A. Kromatografi Cair B. Kromatografi Gas

Kolom Planar

Lapis Tipis Terbuka

(Twsett)

Tertutup

(KCKT)

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Pemisahan_campuran&action=edit&redlink=1


Kromatografi dapat digunakan untuk preparatif atau analisa kualitatif dan

kuantitatif. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa

yaitu fasa tetap (stationary) dan fasa bergerak (mobile), pemisahan-

pemisahannya tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut.

Persyaratan utama kromatografi adalah :

1). Ada fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam tidak boleh bereaksi

dengan fasa gerak.

2). Komponen sampel (contoh) harus larut dalam fasa gerak dan

berinteraksi dengan fasa tetap (diam).

3). Fasa gerak harus bisa mengalir melewati fasa diam, sedangkan

fasa diam harus terikat kuat di posisinya.

Berdasarkan cara kontak antara fasa diam dan fasa gerak, dikenal

kelompok kromatografi kolom dan kromatografi planar,sebagai berikut :

1. Kromatografi kolom : fasa diam ditahan dalam sebuah kolom

sempit (terbuka di kedua ujungnya). Fasa gerak mengalir karena

efek gravitasi atau tekanan. Fasa diam umumnya berupa

padatan atau cairan. Fasa gerak umumnya berupa cairan atau gas

dan dialirkan terus menerus. Hasil pemisahan adalah spesi yang

keluar dari kolom.

2. Kromatografi planar : fasa diam didukung oleh (dilapiskan pada)

plat datar atau lembaran. Fasa gerak bergerak berdasarkan aksi

kapiler atau gaya gravitasi. Fasa diam umumnya adalah padatan,

sedangkan fasa gerak umumnya adalah cairan. Fasa gerak

dialirkan hanya sampai mendekati akhir bidang fasa diam. Hasil

pemisahan berua spot-spot pada lintasan (tract) yang dijalani oleh

sampel.

Cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap,

yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat

maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan (absorption

chromatography), dan jika zaf cair dikenal sebagai kromatografi partisi


(partition chromatography). Karena fasa gerak dapat berupa zat cair atau gas

maka semua ada empat macam sistem kromatografi. Keempat rnacam sistem

kromatografi tersebut adalah :

1). Fasa gerak zat cair - fasa tetap padat : Komatografi penukar ion.

2). Fasa gerak gas - fasa tetap padat : Kromatografi gas padat

3). Fasa gerak zat cair - fasa tetap zat cair, dikenal sebagai

kromatografi partisi dan kromatografi kertas.

4). Fasa gerak gas - fasa tetap zat cair : Kromatografi gas-air dan

Kromatografi kolom kapiler.

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada senyawa-

senyawa yang dipisahkan, sehingga terdistribusi sendiri diantara fasa

gerak dan fasa tetap dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda

dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain.

c. Kromatografi Partisi

Perbedaan yang pokok adalah terletak pada sifat dari penyerap, dimana

dalam kromatografi partisi berupa materi yang berpori, seperti

kieselguhr, yang dilapisi dengan lapisan dari zat cair sering

menggunakan air. Fasa tetap adalah lapisan zat cair dan zat padat yang

berperan sebagai penyangga/penyokong. Jika fasa-fasa bergerak dan

tetap keduanya berupa zat cair maka akan diperoleh kromatografi zat

cair-cair.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran tidak

tergantung pada kelarutannya dalam fasa tetap, yang berupa zat cair

sehingga senyawa-senyawa yang lebih larut akan bergerak lebih lambat

turunnya dalam kolom daripada yang kurang kelarutannya. Selama

bergerak senyawa-senaywa mengalami partisi di antara dua fasa, dan

pemisahan terjadi karena perbedaan dalam koefisien partisi.

Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, d imana lembaran

kertas adalah sebagai pengisi/pengganti dari kolom. Kromatografi


campuran dari senyawa yang dipisahkan membentuk suatu jalur dalam

kolom.

1.2. Kromatografi Serapan/Kolom

a. Kolom Serapan

Untuk memisahkan suatu campuran, kolom seperti gambar l.a dapat

digunakan dan diisi dengan penyerap zat padat seperti alumina sebagai fasa

tetap dan dialiri dengan pelarut seperti benzena sebagai fasa gerak

b a

Sejumlah kecil cuplikan dari campuran dimasukkan melalui sebelah atas dari

kolom yang kemudian membentuk jalur-jalur serapan dari senyawa, seperti

gambar Ib. Bila pelarut dibiarkan mengalir melalui kolom ia akan

mengangkut senyawa-senyawa yang merupakan komponen-komponen

dari campuran.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada berapa

besarnya zat terhambat/tertahan oleh penyerap di dalam kolom. Jadi

suatu senyawa yang diserap lemah akan bergerak lebih cepat daripada

yang diserap kuat. Akan terlihat bahwa jika perbedaan-perbedaan dalam

serapan cukup besar maka akan terjadi pemisahan yang sempurna,

seperti terlihat pada gambar 1b.

Bentuk kolom serapan yang sederhana telah ditunjukkan seperti dalam garnbar

1a. Bentuk ini merupakan jenis yang pertama-tama digunakan untuk

pemisahan-pernisahan kromatografi hingga sampai sekarang.

gambar I 1a. Pemisahan suatu campuran dengan kolom kromatografi. 1b. Jalur-jalur serapan


Kolom krornatografi dapat berupa pipa gelas yang dilengkapi dengan kran dan

gelas penyaring di dalamnya. Meskipun kolom-kolom dapat dibuat secara

sederhana dari tabung gelas, kadang-kadang buret pun dapat digunakan.

Ukuran kolom tergantung pada banyaknya zat yang akan dipisahkan. Untuk

menahan penyerap yang diletakkan di dalam kolom dapat digunakan gelas wool

atau kapas, lihat gambar 2 a dan b.

a

b.

a. Pengisian Kolom

Pengisian kolom adalah tidak mudah untuk mernperoleh pengisian kolom yang

homogen, tetapi perlu dicoba hingga mendapatkan hasil yang maksimurn.

Pengisian yang tidak teratur dari penyerap akan mengakibatkan merusak batas-

batas pita krommatografi. Putusnya penyerap dalam kolom biasanya

disebabkan oleh gelembung-gelembung udara selama pengisian. Untuk

Gambar 2 Kolom untuk kromatografi


rnencegah hal-hal tersebut sedapat mungkin zat pengisi/penyerap dibuat

menjadi "bubur" dengan pelarut kemudian dituangkan perlahan-lahan dalam

tabung. Jika penyerap dibiarkan turun perlahan-lahan dapat ditolong dengan

mengguncang perlahan-lahan maka akan diperoleh pengisian yang homogen.

Jika besarnya partikel-partikel penyerap sama, akan lebih mudah untuk

mendapatkan pengisian yang homogen. Tetapi hal ini sangat jarang. Harus

diperhatikan penyerap yang telah dimasukkan jangan sampai ada bagian yang

kering baik selama pengisian atau selama pemisahan.

1.3. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas termasuk dalam kelompok kromatografi planar,

dimana pemisahannya menggunakan medium pemisah dalam bentuk

bidang datar yaitu benuk kertas. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase

diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase

gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa

komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen

yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.

Kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase

gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan Kromatografi kertas

telah dilakukan dimana proses dikenal sebagai "analisa Kapiler".

Metoda-metoda ini sangat sesuai dengan kromatografi serapan, dan

sekarang kromatografi kertas dipandang sebagai perkembangan dari

sistem partisi. Salah satu zat padat dapat digunakan untuk menyokong

fasa tetap yaitu bubuk selulosa.

Mula-mula telah dilakukan pemisahan asam-asam amino dan peptida-

peptida yang merupakan hasil hidrolisa protein wool dengan suatu cara

di mana kolom yang berisi bubuk diganti dengan lembaran kertas dan

kemudian diletakkan dalam bejana tertutup yang berisi uap jenuh

larutan. Ini adalah merupakan jenis dari sistem partisi dimana fasa tetap

adalah air, disokong oleh molekul-molekul selulose dari kertas, dan fasa


bergerak biasanya merupakan campuran dari satu atau lebih pelarut-

pelarut organik dan air.

Suatu hal yang perlu diperhatikan disini adalah tentang peralatan. Pada

kromatografi Kertas peralatan yang dipakai tidak perlu alat-alat yang teliti

atau mahal. Hasil-hasil yang baik dapat diperoleh dengan peralatan dan

materi-materi yang sangat sederhana. Senyawa-senyawa yang

terpisahkan dapat dideteksi pada kertas dan dapat segera diidentifikasi.

Bahkan komponen-komponen yang terpisahkan dapat diambil dari

kertas dengan jalan memotong-motongnya yang kemudian dilarutkan

secara terpisah.

Meskipun kromatografi kertas sangat mudah pengerjaannya, tetapi sangat sulit

dijelaskan apabila membadingkannya dengan kromatografi lapis tipis.

Penjelasannya tergantung tingkatan pemilihan pelarut yang anda gunakan, dan

beberapa sumber untuk mengatasi masalah secara tuntas. Jika anda telah

pernah melakukannya, ini sangat membantu jika anda dapat membaca

penjelasan bagaimana kromatografi lapis tipis bekerja.

Struktur dasar kertas

Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula

sederhana, yaitu glukosa.

Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas dalam

kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang

berbeda pada permukaan kertas. Dengan kata lain, akan baik menggunakan

beberapa penjelasan untuk kromatografi lapis tipis dan kertas. Sayangnya, hal

ini lebih kompleks daripada itu! Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa

beratraksi dengan uap air dari atmosfer sebagaimana halnya air yang timbul


pada saat pembuatan kertas. Oleh karenanya, anda dapat berpikir yakni kertas

sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang sangat tipis dari molekul-

molekul air yang berikatan pada permukaan. Interaksi ini dengan air merupakan

efek yang sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.

1.3.Kromatografi Lapisan Tipis (Thin Layer Chromatography, TlC)

Teknik TLC/KLT fasa diam (terutama silika, alumina, dan selulosa)

dilapiskan di permukaan sebuah plat pendukung (umumnya dibuat dari

bahan kaca atau lembaran logam Al). Bila noda telah kering plat

diletakkan secara vertikal dalam bejana yang sesuai dengan tepi yang di

bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak, maka pemisahan kromatografi

penaikan akan diperoleh. Pada akhir perkembangan, pelarut dibiarkan

menguap dari plat dan noda-noda yang terpisah dilokalisir dan

diidentifikasi dengan cara fisika dan kimia seperti yang digunakan dalam

kromatografi kertas.

1) Metoda Kromatografi Lapisan Tipis

Kromatografi serapan dalam bentuk lapisan tipis yang dilekatkan pada

suatu penyokong telah diketengahkan dalam tahun 1938. Pertamakali

dicoba untuk memisahkan terpen-terpen. Pada "Cromatostrip" yang

dibuat melapisi` potongan gelas kecil dengan penyerap yang dicampur

dengan pati atau perekat sebagai pengikat.

Perkembangan lebih lanjut STHAL telah mernbuat cara-cara pembuatan

potongan gelas dan cara melapiskannya serta menunjukkan bahwa kromatografi

lapisan tipis dapat digunakan untuk keperluan yang luas dalam pernisahan-

pemisahan. Metoda kromatografi kertas memberikan hasil pemisahan dengan

waktu yang lebih cepat dan lebih baik.

2) Jenis Penyerap

Sifat-sifat umum dari penyerap untuk kromatografi lapisan tipis adalah

mirip dengan sifat-sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat yang

penting dari penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena

adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada jenis penyerap. Besar


partikel yang biasa digunakan adalah 1 - 25 mikron. Partikel yang

butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan

dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah

menggunakan penyerap yang butirannya halus. Sedangkan dalam kolom

partikel yang sangat halus akan mengakibatkan aliran pelarut menjadi

lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus memberikan aliran pelarut

yang lebih cepat.

Beberapa contoh penyerap yang digunakan untuk pemisahan dalam

kromatografi lapisan tipis adalah sebagai berikut dalam tabel 1.

Tabel 1. Jenis Penyerap untuk Kromatografi Lapisan Tipis

zat padat Digunakan untuk memisahkan

- Silika

- Alumina

- Kieselguhr

-Bubuk selulosa

- Pati

Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam

lemak, lipida, minyak esensial, anion dan kation

organik, sterol, terpenoid

Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-

vitamin, karoten, asam-asam amino

Gula, oligosakarida, asam-asam dibasa, asam-

asam lemak, Irigliscrida, asam-asam amino,

steroid alkaloid, nukleotida

asam-asam amino

asam-asam amino,protein

e. Kromatografi Gas

Kromatografi gas merupakan sekelompok teknik pemisahan kromatografi

yang menggunakan gas sebagai fasa gerak. Karena gas bersifat menyebar ke

ruang disekelilingnya. maka tidak ada kromatografi gas dalam bentuk planar,

semua kromatografi gas berbentuk kolom. Kolom untuk kromatografi gas

biasanya dibuat dari bahan logam nir-karat atau dari bahan gelas. Di dalam

alur pemisahan, fasa sampel juga berupa gas. Karena umumnya sampel


untuk kromatografi gas berfasa cair, maka sistem pemisahan kromatografi

gas memerlukan pemanasan. Disisi lain, stabilitas gas sangat dipengaruhi

temperatur, sehingga walaupun sampel sudah berfasa gas, sistem

pemanasan untuk memungkinkan pengendalian temperatur tetap diperlukan.

Kromatografi gas (Gas chromatography, disingkat GC) termasuk alat-alat

analisa. Analisa dapat dibagi menjadi :

1. Analisa Kualitatif, yaitu penentuan sifat-sifat dari suatu komponen atau

campuran dari komponen.

2. Analisa Kuantitati, yaitu penentuan jumlah dari suatu komponen atau

komponen-komponen dalam suatu campuran.

Kromatografi gas dijajarkan sebagai cara analisa yang dapat

digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa organik.

Berdasarkan fasa diam, dikenal ada dua tipe kromatografi gas

yaitu :

1. Kromatografi padat -gas (Gas Solid Cromatography, GSC).

2. Kromatograf i cairan-gas (Gas Liquid Cromatography, GLC).

Dalam kedua hal ini sebagai fasa gerak adalah gas (hingga

keduanya disebut kromatografi gas) tetapi fasa diamnya berbeda .

Meskipun demikian kedua cara tersebut mempunyai banyak

persamaan cara kerja. Pada GSC kita mempunyai absorbsi

(absorpsi) dan dalam GLC kita mempunyai partisi (larutan).

Pengoperasian GSC memerlukan tingkat keahlian yang lebih tinggi dari

GLC, shingga relatif jarang digunakan. penyebabnya adalah GSC

berdasarkan fasa diam padat, sehingga gaya tambat analit berdasarkan

adsorpsi fisik. Gaya tambat ini bersifat semi permanen terhadap molekul

polar atau molekul aktif sehingga proses adsorpsi bersifat tidak linier,

akibatnya pik hasil elusi menjadi sangat berekor (tailing). GLC relatif lebih

mudah dioperasikan sehingga digunakan secara luas disegala bidang sains,

dan nama GLC sering disingkat menjadi Kromatografi Gas (GC).

a). Kromatografi padat-gas (Gas Solid Cromatography, GSC).


Kromatografi Gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat

yang mudah menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu fasa

diam (stationary phase). Dasar kerja dari GSC adalah adsorbsi (serapan).

Dengan alasan ini maka GSC sangat sukar untuk digunakan secara

berulang dengan hasil yang sama. Hal ini disebabkan oleh kenyataan-

kenyataan bahwa :

1. Aktivitas dari penyerap (adsorbent) tergantung pada cara

pembuatannya.

2. Juga aktivitas tergantung pada bagaimana ia diperlakukan setelah

pembuatannya.

Keadaan 1 dan 2 sangat sukar untuk distandarisasi. Hal-hal inilah yang

menyebabkan "Reproducibility" yang rendah dari GSC. Yang sering dijumpai

adalah :

a. Puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak

homogen dari penyerap.

b. Waktu retensi relatif panjang.

c. Waktu retensi sangat tergantung pada jumlah dari cuplikan.

d. Kernungkinan penyerap.dapat berperan sebagai katalisator yang aktif.

Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik untuk

senyawa yang mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi. Meskipun

demikian ada keuntungan dari GSC bila dibandingkan dengan GLC. Fasa

diam tidak dapat diuapkan, karena tekanan uap dari padatan sangat rendah.

Hingga dapat menggunakan detektor-detektor yang sensitif, karena di sini

tidak terjadi "column bleeding".

Dalam tahun akhir-akhir ini GSC menjadi lebih penting yaitu setelah

diketemukannya penyerap-penyerap yang lebih baik. Contoh-contoh

penyerap adalah :

1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen

(dibandingkan dengan diamond) : ini digunaaan terhadap senyawa-senyawa

polar yang titik didihnya tinggi.


2) “molecular sieves" : ini merupakan zeolit buatan (= Na- atau CaAI-

silikat), dengan pori-pori yang sangat kecil/halus di dalamnya. Ukuran dari

diameter pori dinyatakan dalam A°. Sebagai contoh "Linde", mempuyai

ukuran dari 3A° hingga 13A°. Zeolit sangat stabil, pada suhu hingga 600°C.

Molecular sieves hanya menyerap molekul-molekul yang lebih kecil dari pori-

porinya. Air sangat cepat diserap hingga merupakan pengering yang

sangat efisien. Molecular sieves mempunyai sifat katalisator yaitu dapat

merupakan zat dehidrator (dehydrating agents). Sebagai contoh zeofit dapat

mengubah alkohol menjadi hidrokarbon/gasolin : R-OH → R-H. Sebelum

digunakan biasanya molecular sieves diaktifkan dengan memanaskannya

selama 12 jam pada suhu 150°C sambil dialiri gas H2 yang kering.

Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti hidrokarbon-hidrokarbon

menyerap sangat kuat. CO2 dan prosesnya tidak dapat balik sehingga zeolit

tidak digunakan bila CO2 dipakai sebagai gas pengangkut.

Perkembangan dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer-

polimer yang berpori seperti PORAPAK dan POLYPAK (nama

perdagangannya) juga CHROMOSORB.

Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :

1. Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2, R-OH

dan glikol-glikol, dan asam-asam lemak rendah.

2. Juga untuk seperti CO2,N2O,O2 juga yang lainnya.

Kromatografi gas yang paling tua digunakan adalah GSC. Dalam

tahun 1800 gas-gas telah dimurnikan dengan menyerapkan pada fasa

diam yang berupa : alumina (AI203), atau pada silica gel (Si O, pasir

yang dimurnikan). Kadang-kadang penyerap ini menjadi tidak aktif bila

terkena oleh air.

b) Kromatografi gas-cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)

Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :

1. Kecepatan :


a. Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengada-

kan kesetimbangan antara fasa bergerak dengan fasa diam.

b. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.Hingga

waktu pemisahan sangat cepat (diukur dalam menit).

2. Sederhana :

Alat GLC relatif sangat mudah dioperasikan. Interprestasi

langsung dari data yang diperoleh dapat dikerjakan. Harga dari

alat GLC relatif murah.

3. Sensitif :

GLC sangat sensitif. Alat yang paling sederhana dapat

mendeteksi konsentrasi dalam ukuran 0,01% (= 100 ppm). Alat-

alat GLC yang lebih rumit dapat mendeteksi senyawa yang

Konsentrasirrya hanya beberapa

Alat yang tertentu sekarang dapat dibuat dengan kemampuan

mendeteksi "parts per billion", hingga dalam jangkauan

pikogram = 10 g.

Disebabkan sensitivitas yang tinggi dari GLC maka hanya

memerlukan sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya dalam

ukuran mikroliter.

4. Pemisahan : (resolution = performance).

Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan moleku-molekul

dari suatu campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan

dengan cara-cara yang lain.

Misalnya pemisahan metil ester-metil ester dari :

1) Asam stearat dengan ttd 232°C pada tekanan 15 mmHg

CH3(CH,)t6 COOH.

2) Asam oleat dengan ttd 229°C pada tekanan 15 mm Hg

CH3(CH,)7CH = CH(CHZ)7COOH:


3) Asam linoleat dengan ttd 237°C pada tekanan I5 mm Hg

CHj(CHZ)4 CH = CH = CHCHZCH = CH (CH,)7COOH.

Senyawa-senyawa tersebut tak mungkin dipisahkan dengan cara

distilasi atau dengan ekstraksi, tetapi sangat mudah dipisahkan

dengan GLC, yang hanya membutuhkan waktu sekitar 23 menit.

5. Analisa dapat digunakan sebagai :

1) Analisa kualitatif yaitu dengan membandingkan waktu retensi.

2) Analisa kuantitatif yaitu dengan penghitungan luas puncak.

3) Alat GLC dapat dipakai dalam waktu yang lama dan berulang-

ulang.

c) Prinsip Krimatografi Gas-Cair (GC)

Prinsip kerja kromatografi gas adalah sampel (cuplikan/analit) diinjeksikan

ke dalam kolom dan diuapkan lalu dielusi oleh aliran gas inert (sebagai fasa

gerak). Pada kromatografi gas, fasa gerak tidak berinteraksi dengan

molekul-molekul analit. Fungsi fasa gerak, hanya berfungsi sebagai

transpor analit atau cuplikan untuk bergerak di sepanjang kolom. Proses

pemisahan terjadi karena perbedaan interaksi analit dengan fasa diam.

Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah

teruapkan masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-

komponen dari cuplikan. Kemudian komponen-komponen dideteksi oleh

detektor, dan sinyal dalam bentuk puncak akan dihasilkan oleh pencatat.

f. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode

kromatografi yang mampu memisahkan campuran makromolekul, senyawa

ionik, produk alam yang labil, senyawa polimerik dan kelompok polifungsional

yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyarian berfraksi,

penyerapan atau penukaran ion.


Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi kolom karena

fasa diamnya diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan bila ditinjau dari

proses pemisahannya KCKT digolongkan dalam kromatografi adsorpsi atau

kromatografi partisi. KCKT/HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam

analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan

serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan

kromatografi kolom.

Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi spesifik

anatara molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak.

KTKC juga merupakan teknik kromatofrafi yang paling banyak digunakan,

dengan keunggulan-keunggulan:

1. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif,

2. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap dan spesi yang

mudah rusak oleh panas,

3. Bisa dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik

seperti untuk analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat,

hidrokarbon, karbohidrat, obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik,

steroid, spesi metal organik, dan berbagai senyawaan norganik.

KCKT menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau

padatan, dan bisa dilbagi menjadi menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam

bisa berupa cairan atau padatan, dan bisa dilbagi menjadi 4 (empat) tipe

utama yaitu:

1. Kromatografi Partisi (Luntuk solut senyawa polar tetapi bukan ionik

berukuran kecil)

2. Kromatografi Adsorpsi atau Kromatografi Padar-cairan (untuk pemisahan

spesi non-polar, isomer struktur,dan klasifikasi senyawa seperti

pemisahan hidrokarbon alifatik dari alkohol alifatik)

3. Kromatografi Ion (untuk spesi ionik ber-Mr rendah)

4. Kromatografi Eklusi-ukuran atau Kromatofrafi Gel (untuk solut dengan Mr

> 1000) yang bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi gel.


2. EVALUASI

1. Definisi kromatografi adalah :...

a. pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan

komponen dalam medium tertentu

b. Teknik pemisahan dengan menggunakan suatu pelarut

anorganik

c. Pemisahan antara satu komponen yang komplek

d. Pemisahan suatu zat dari senyawa yang tak dapat dipisahkan

e. Teknik Teknik pemisahan dari suatu sampel yang sangat

banyak jumlahnya

2. Persyaratan utama yang harus diperhatikan dalam kromatografi

adalah :...

a. Fasa diam harus bereaksi dengan fasa gerak.

b. Adanya fasa diam dan fasa gerak

c. Fasa gerak tidak perlu mengalir melewati fasa diam

d. Komponen sampel tidak larut dalam fasa gerak

e. Fasa gerak tidak berinteraksi dengan fasa diam.

3. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu :

...

a. Fasa tetap dan fasa bergerak

b. Fasa tetap dan fasa diam

c. Fasa tetap dan stationary

d. Fasa mobile dan fasa cair

e. Fasa gas dan fasa cair

4. Fase diam dalam kromatografi kertas adalah :...

a. Kertas serap

b. Pelarut atau campuran pelarut yang sesuai

c. Medium plat

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Pemisahan_campuran&action=edit&redlink=1


d. Lapisan tipis dalam kaca/plat

e. Membran


B. KEGIATAN PEMBELAJARAN 2. MENYIAPKAN SAMPEL DAN STANDAR 3. LEMBAR INFORMASI

1.1. Menyiapkan Sampel dan Standar untuk Kromatografi Kertas

a. Sampel dalam bentuk cair biasanya langsung di totolkan diatas kertas,

seanndainya sampel tersebut terlalu encer dilakukan penguapan

sampai agak kental.

b. Sampel dalam bentuk padat sebelum dilakukan pemisahan dengan

kromatografi kertas harus dilakukan preparasi terlebih dahulu dengan cara

dihaluskan dan dilarutkan dengan pelarut organik misal

khloroform/heksan/dietil eter/alkohol dan lain-lain sampai diperoleh sampel

yang siap untuk ditotolkan diatas kertas.

c. Langkah Kerja Kromatografi Kertas

Setetes dari larutan cuplikan yang mengandung campuran yang akan

dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di

atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda

yang bulat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana

tertutup yang sesuai dengan satu ujung dimana tetesan cuplikan

ditempatkan dan tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa

bergerak (jangan sampai noda tercelup karena senyawa yang akan

dipisahkan akan terlarut dari kertas), lihat gambar 4a.

Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler dan

menggerakkan komponen-komponen dari campuran cuplikan pada

perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Perlu diperhatikan bahwa per-

mukaan dari kertas jangan sampai terlalu basah dengan pelarut karena

hal ini tak akan memisahkan sama sekali atau daerah-daerah noda akan

menjadi kabur. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang

cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, maka kertas

diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda

dan lembaran kertas dibiarkan kering.


Gambar 4. Kromatografi pita/noda.

Jika senyawa-senyawa tak berwarna maka mereka dideteksi dengan cara

fisika dan kimia. Cara yang biasa adalah menggunakan suatu pereaksi

atau pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap

beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Sering juga menggunakan

cara deteksi dengan sinar ultra ungu atau teknik radio kimia. Bila daerah-

daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, adalah perlu untuk

mengidentifikasi tiap-tiap individu dari senyawa.

Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada

kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan

harga Rf. Terutama pada gugus-gugus yang besar dari senyawa-senyawa

yang susunan kimianya mirip, seperti asam-asam amino, harga Rf sangat

berdekatan satu sama lain. Dalam hal ini perlu melakukan teknik dua

jalan. Kertas yang berbentuk persegi digunakan dan cuplikan ditempatkan

pada satu sudut. Pengembangan dengan campuran pelarut 1, dengan

ujung kertas AB dicelupkan, memberikan pemisahan sebagian seperti

ditunjukkan dalam gambar 5 a. Lembaran kertas diambil dan dikeringkan

dan kemudian dimasukkan dalam bejana kedua dengan ujung AC

dicelupkan dalam pelarut 2. Pengembangan dengan pelarut ini, diikuti

dengan pengeringan dan pemberian pereaksi tertentu akan memberikan

noda-noda seperti gambar 5b.


A B

Permukaan pelarut

C D

Pelarut 2

5. a 5. b

Gambar 5. kromatografi dua jalan

Kertas saring dapat digantungkan/diletakkan sehingga pelarut bergerak

ke atas, ke bawah atau mendatar. Hasil-hasil dari metoda pertama dan

kedua adalah mirip tetapi berbeda dari metoda ketiga.

Dalam metoda penaikkan (ascending) kertas dicelupkan hingga ujung di

mana aliran mulai bergerak terletak sedikit di atas permukaan dari pelarut

dan pelarut naik melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler. Di

dalam metoda penurunan (descending) ujung alas dari kertas dicelupkan

dalam pelarut dan mengalir, meskipun diawali oleh gaya kapiler

diteruskan oleh gravitasi. Metoda mendatar (horizontal) sangat berbeda

dari kedua metoda di atas. Noda cuplikan ditempatkan pada pusat dari

kertas (biasanya kertas saring berbentuk bulat) dan pelarut diteteskan

juga di pusat kertas. Aliran juga oleh gaya kapiler, senyawa-senyawa

dalam campuran segera berkembang dengan pelarut.

Bila akan melakukan pemisahan dengan kromatografi kertas, maka hal-

hal yang perlu diperhatikan adalah :

1. Metoda (penaikan, penurunan atau mendatar)

2. Macam dari kertas

3. Pemilihan dan pembuatan pelarut (fasa bergerak)

4. Kesetimbangan dalam bejana yang dipilih


5. Pembuatan cuplikan

6. Waktu pengembangan

7. Metoda deteksi dan identifikasi

Disamping sifat-sifat dari kertas dan pelarut, ada faktor-faktor penting

yang mempengaruhi pemisahan yaitu : suhu, besarnya bejana, waktu

pengembangan dan arah dari aliran pelarut.

d. Alat dan Teknik

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau

campuran pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa

batas pelarut berada dibawah garis pada bercak diatasnya. Gambar

berikutnya tidak menunjukkan terperinci bagaimana kertas di

gantungkan karena terlalu banyak kemungkinan untuk mengerjakannnya

dan dapat mengacaukan gambar. Kadang-kadang kertas hanya

digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas

pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan

posisi berdiri pada bawah wadah.

Alasan penutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer

dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara

dalam gelas kimia dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama

halnyadengan pergerakan pelarut pada kertas.

Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang

berbeda dari campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan

campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.

Gambar menunjukkan apa yang tampak setelah pelarut telah bergerak


hampir seluruhnya ke atas.

Dengan sangat mudah dijelaskan melihat dari kromatogram akhir dari

pena yang ditulis pada pesan yang mengandung pewarna yang sama

dengan pena 2. Anda juga dapat melihat bahwa pena 1 mengandung dua

campuran berwarna biru yang kemungkinan salah satunya mengandung

pewarna tunggal terdapat dalam pena 3. Nilai Rf.

Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang

ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar.

Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa

tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama,

misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat. Jarak relative

pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku

rumus sebagai berikut:

jarak yang ditempuh oleh senyawa Rf =

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bergerak 9.6 cm dari

garis dasar, sedangkan pelarut bergerak sejauh 12.0 cm, jadi Rf untuk

komponen itu:

Dalam contoh kita melihat ada beberapa pena, tidak perlu menghitung

nilai Rf karena anda akan membuat perbandingan langsung dengan

hanya melihat kromatogram. Anda membuat asumsi bahwa jika anda

memiliki dua bercak pada kromatogram akhir dengan warna yang sama

dan telah bergerak pada jarak yang sama pada kertas, dua bercak


tersebut merupakan senyawa yang hampir sama. Hal ini tidak selalu

benar. Anda dapat saja mempunyai senyawa-senyawa berwarna yang

sangat mirip dengan nilai Rf yang juga sangat mirip.

d. Bagaimana Jika Substansi yang Diidentifikasi Tidak Berwarna?

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan membuat bercak menjadi tampak

dengan mereaksikannya dari beberapa pereaksi yang menghasilkan

produk yang berwarna. Contoh yang baik yaitu kromatogram yang

dihasilkan dari campuran asam amino.

Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin

memisahkan asam amino tertentu yang terdapat dalam campuran. Untuk

menyederhanakan, mari berasumsi bahwa anda telah mengetahui

kemungkinan campuran hanya mengandung lima asam amino yang

umum.

Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis dasar kertas, dan

dengan cara yang sama ditempatkan asam amino yang telah diketahui

diteteskan disampingnya. Kertas lalu ditempatkan dalam pelarut yang

sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran

adalah M, dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1 sampai 5.

Posisi pelarut depan ditandai dengan pinsil dan kromatogram lalu

dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin

bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa berwarna,

utamanya coklat atau ungu.

Gambar di sebelah kiri menunjukkan kertas setelah dilalui pelarut

hampir pada bagian atas kertas. Bercak masih belum tampak. Gambar

kedua menunjukkan apa yang mungkin tampak setelah penyemprotan


ninhidrin.

Tidak diperlukan untuk menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah

dapat membandingkan bercak dalam campuran dengan asam amino-

asam amino yang telah diketahui berdasarkan posisi dan warnanya.

Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino yang diberi

tanda 1,4 dan 5. Bagaimana jika campuran mengandung asam amino

lain selain dari asam amino yang anda gunakan untuk perbandingan?

Akan terdapat bercak dalam campuran yang tidak sesuai dari asam

amino yang telah diketahui. Anda harus mengulangi percobaan

menggunakan asam amino-asam amino sebagai bahan perbandingan.

e. Kromatografi Kertas Dua Arah.

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan

masalah pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat

serupa.

Pada senyawa-senyawa berwarna lebih mudah melihat apa yang

terjadi. Anda dapat mengerjakannya secara sempurna hal ini dengan

senyawa-senyawa yang tidak berwarna, tetapi anda harus

menggunakan banyak imajinasi dalam menjelaskan apa yang terjadi.

Kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang

ditempatkan kedepan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan dalam

sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian

atas kertas. Dalam gambar, posisi pelarut ditandai dengan pinsil

sebelum kertas kering. Posisi ini ditandai sebagai SF1 yaitu pelarut

depan untuk pelarut pertama. Kita akan menggunakan dua pelarut yang

berbeda


Jika anda melihatnya lebih dekat, anda dapat melihat bahwa bercak

pusat besar dalam kromatogram sebagian biru dan sebagian hijau. Dua

pewarna dalam campuran memiliki nilai Rf yang hampir sama.

Tentunya, nilai-nilai ini bisa saja sama, keduanya memiliki warna yang

sama; dalam hal ini anda tidak dapat mengatakan bahwa ada satu atau

lebih pewarna dalam dalam bercak itu. Apa yang anda kerjakan

sekarang adalah menunggu kertas kering seluruhnya, dan putar 90o C

dan perlakukan kromatogram kembali dengan pelarut yang berbeda.

Gambar berikutnya menunjukkan apa yang mungkin terjadi pada

berbagai bercak pada kromatogram awal. Posisi pelarut kedua juga

ditandai.

Tentunya anda tidak dapat melihat bercak-bercak dalam posisi awal dan

akhir; Bercak-bercak telah bergerak! Kromatogram akhir akan tampak

seperti ini:

Kromatografi dua arah secara seluruhnya terpisah dari campuran

menjadi empat bercak yang berbeda. Jika anda akan mengidentifikasi

bercak-bercak dalam campuran, secara jelas anda tidak dapat

melaksanakannya dengan perbandingan substansi pada kromatogram

yang sama seperti pada contoh sebelumnya menggunakan pena atau

asam amino-asam amino. Anda dapat berakhir dengan kekacauan pada

bercak-bercak yang tanpa arti. Meskipun demikian, anda dapat bekerja


dengan nilai Rf untuk setiap bercak-bercak dalam pelarut-pelarut, dan

kemudian membandingkan nilai-nilai yang anda telah ukur dari senyawa

yang telah diketahui pada kondisi yang tepat sama.

f. Jenis Kertas

Pekerjaan mula-mula dalam kromatografi kertas dilakukan dengan

menggunakan kertas saring Whatmann No, 1. Jenis kertas whatman

dengan berbagai nomer banyak digunakan dengan kemurnian yang

tinggi dan tebal merata. Kertas dalam pemisahan terutama

mempunyai pengaruh pada kecepatan aliran pelarut. Sedangkan fungsi

dari kertas sendiri sangat kompleks. Efek-efek serapan disebabkan

oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil. Kecepatan aliran naik

dengan penurunan kekentalan dari pelarut (dengan kenaikan dalam

suhu), tetapi aliran pelarut pada suhu yang tertentu ditentukan oleh

kerapatan dan tebal dari kertas. Penurunan kerapatan atau kenaikan

tebal memberikan kecepatan aliran yang lebih tinggi. Kertas

disediakan dalam bermacam-macam standar lembaran, bulatan,

gulungan dan dalam bentuk tertentu. kertas harus disimpan ditempat

jauh dari setiap sumber dari uap (terutama ammunia yang mempunyai

afinitas yang tinggi terhadap selulosa).


g. Jenis Pelarut

Fasa gerak merupakan campuran yang terdiri dari stu komponen

organik utama, air, dan berbagai tambahan misalnya asam-asam,

basa atau pereaksi komplek. Pelarut harus sangat mudah menguap,

karena terlampau cepat mengadakan kesetimbangan, keadaan lain

volatilitas yang tinggi mengakibatkan lebih cepat hilang

meninggalkan lembaran kertas setelah bergerak. Ion-ion anorganik

dipisahkan sebagai ion-ion komplek dengan beberapa kelarutan

dalam pelarut-pelarut organik, misal besi membentuk ion klorida

kompleks yang larut dalam aseton berair, sedang nikel tidak segera

membentuk ion seperti besi sehingga besi dan nikel dapat

dipisahkan dengan pelarut ini, sejauh asam klorida berada untuk

menstabilkan ion kompleks. Beberapa contoh dari macam-macam

campuran pelarut dapat dilihat seperti pada tabel 3.

Untuk mendapatkan hasil campuran pelarut yang tak dapat diulang lagi

maka harus dibuat hati-hati meskipun hanya dengan gelas ukur. Pelarut

jangan dipakai setelah selang beberapa lama. Untuk pengembangan

selama satu malam pelarut hanya digunakan satu kali pakai. Untuk

penggunaan pelarut-pelarut yang mudah menguap maka pemakaiannya

dalam keadaan yang baru saja dibuat.

Tabel 3. Jenis-jenis Pelarut untuk KromatografI Kertas

Pemisahan Pelarut Perbandingan

Asam-asam atnino fenol/air larutan jenuh

n-butanol/as.cuka/air 4:1:5

n-butanol/as.cuka/air 12:3:5

n-bu OH/pir idin/air 1:1:1

Karbihidrat (gula) et i l asetat/pir idin/air 2:1:2

et i l asetat/n-PrOH/air 6:1:3

Eti l asetat/as. cuka/air 3:1:3

Asam-asam lemak n-butanol/1,5 M NH3 Larutan jenuh

Fe, CI, Hr, J (garam-garam Na) pir idin/air 90: 10

Hg, Pb, Cd, Cu. Bi (klorida-klorida) n-butanol/3M HCl larutan jenuh

h. Cara Penempatan Cuplikan pada Kertas


Larutan carnpuran yang akan dipisahkan ditempatkan pada kertas yang

berupa noda. la biasanya dibiarkan untuk berkembang membentuk suatu

bulatan. Bagian dari kertas yang ditetesi dibiarkan dalam keadaan

mendatar, sehingga larutan tetap dalam keadaan kompak dalam bentuk

bulatan. Kertas jangan sampai tersentuh oleh zat-zat yang tak dikehendaki.

Besarnya noda tergantung pada percobaan, tetapi diameter harus tak lebih

dari kira-kira 0,5 cm. Diameter ini dihubungkan dengan tebal dan

karakteristik serapan dari kertas, tetapi biasanya noda yang lebih kecil

akan menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

Dalam penempatan cuplikan dalam kertas yang penting bukan jumlah

volume, tetapi banyaknya campuran yang tertinggal bila pelarut telah

teruapkan. Jika larutan terlalu encer untuk ditempatkan sekali, maka

[arutan dapat "dipekatkan" di atas kertas dengan cara meneteskan berkali-

kali pada tempat yang sama, dengan jarak waktu setelah tetes yang per-

tama kering baru tetes yang kedua dan seterusnya. Noda sebaiknya

dibiarkan kering dalam udara, tetapi bila mungkin dapat dikeringkan

dengan menggunakan kipas angin. Dalam pengeringan jangan

menggunakan udara panas, terutama jika larutan bersifat asam, karena ia

dapat menyebabkan kertas menjadi hitam.

Harus dicegah penempatan larutan terlalu banyak. Karena kelebihan setiap

komponen akan menyebabkan tidak akan tercapainya kesetimbangan

partisi selama ia bergerak, hingga ia akan mengakibatkan terjadinya

kedudukan/lokasi yang kabur. Ada beberapa cara pembuatan noda. Salah

satu caranya adalah dengan menggunakan gelas kapiler dengan diameter

yang sama, di mana cara ini yang sering digunakan. Sedangkan cara yang

lain dapat menggunakan alat penyuntik.

Kedudukan dari permukaan pelarut yang terdapat pada kertas harus selalu

diberi tanda segera setelah lembaran kertas diambil dan kemudian

dikeringkan, dengan cara digantungkan. Penandaan dapat menggunakan

pensil pada sisi samping kertas. Pengeringan sebaiknya dibiarkan dalam

udara, bila dikehendaki dapat menggunakan kipas angin, jangan

mengeringkan dengan menggunakan udara panas, karena dapat merusak

http://noda.la/


beberapa konstituen dari campuran. Aliran udara harus paralel terhadap

permukaan dari kertas.

Kebanyakan dari pelarut-pelarut kromatografi cepat menguap tanpa

meninggalkan residu. Hanya untuk fenol, di mana untuk menguapkan

sempurna membutuhkan waktu kira-kira empat jam. Harus diusahakan

penghilangan pelarut secara sempurna, hal ini untuk mencegah pengaruh

pada penambahan pereaksi. Yang penting lagi terutama dalam

kromatografi dua jalan di mana jejak pelarut yang pertama harus hilang

sebelum penjalanan yang kedua. Untuk alasan ini adalah paling baik

menggunakan pertama-tama pelarut yang lebih mudah menguap (jadi, n-

butanol/asam cuka/air). Untuk mendapatkan hasil yang dapat diulang

kembali maka urutan pekerjaan harus dilakukan sama.

i. Deteksi Daerah-daerah Noda

Keberhasilan dari pemisahan kromatografi tergantung juga pada proses

deteksi. Senyawa-senyawa yang berwarna tentu saja terlihat sebagai noda-

noda berwarna yang terpisah pada akhir pengembangan. Un[uk senyawa-

senyawa tak berwarna memerlukan deteksi secara kimia clan fisika. Sering

menjadi pekerjaan rutin bahwa kromatogram-kromatogram diuji di bawah

sinar ultra violet sebelum dan sesudah setiap metoda dikerjakan.

Panjang gelombang yang digunakan biasanya 370 millimikron dan 254

millimikron. Beberapa senyawa terlihat sebagai bintik fluoresence. Metoda

fisika lainnya, terutama hanya dapat dipakai terhadap senyawa-senyawa

radioaktif, yaitu berdasarkan autoradiografi dan pencacahan. Metode-

metode kimia adalah merupakan deteksi yang paling penting. Pereaksi-

pereaksi yang digunakan biasanya dinyatakan sebagai "pereaksi-pereaksi

lokasi". Pereaksi lokasi menggunakan pelarut yang baik, yang diikuti

dengan penguapan. Pelarut yang ideal adalah semua senyawa-senyawa

yang terpisah tidak larut tetapi hal ini tidak mungkin. Cara menggunakan

untuk mendeteksi noda yaitu dengan jalan penyemprotan.

Penyemprotan dilakukan perlahan-lahan dari samping ke samping dan dari

atas ke bawah. Pelarut yang digunakan untuk penyemprotan harus tidak


menguap. Tetapi di lain fihak, penguapan yang cepat dari kertas diperlukan

untuk mencegah difusi dari noda-noda yang terpisah. Pelarut-pelarut yang

digunakan adalah etanol, propanol, n-butanol atau kloroform atau

campuran daripadanya. Campuran berair dapat digunakan, tetapi terlalu

banyak air harus dicegah jika mungkin, karena dapat memberikan efek

melemahkan kertas. Penyemprotan kertas harus dilakukan dalam lemari

asam. Selesai penyemprotan alat harus dibersihkan untuk mencegah

lobang penyemprot menjadi buntu.

Pereaksi yang digunakan untuk mendeteksi asam-asam amino biasanya

ninhidrin (indanatrion hidrat). Pada suhu kamar pereaksi baru mernberikan

warna pada asam-asam amino kira-kira setelah dua puluh empat jam. Tetapi pada

pernanasan pada 100°C warna akan timbul setelah kira-kira empat menit.

Di dalam teknik pencelupan, larutan pereaksi dimasukkan dalam tempat

bejana yang dangkal, dan lembaran atau potongan kertas dicelupkan di

dalamnya. Ada beberapa keuntungan dalam pencelupan hanya

membutuhkan bejana yang murah. Pelarut yang lebih mudah menguap

dapat digunakan, hingga dapat mengurangi waktu yang dibutuhkan untuk

pengeringan hingga mengurangi bahaya difusi dari noda-noda selama

pengeringan. Aseton dapat digunakan sebagai pelarut. Tetapi yang sering

terjadi adalah bahwa senyawa-senyawa yang terpisah sangat larut dalam

pelarut yang terbaik untuk pereaksi lokasi. Hingga metoda pencelupan

sering menyebabkan hilangnya materi maka dalam hal ini metoda penyem-

protan sangat penting.

j. Identifikasi dari Senyawa-senyawa

Mengidentifikasi noda-noda dalam kertas menggunakan harga Rf

(retordation factor) yang didefinisikan sebagai :

Jarak yang digerakkan oleh senyawa Rf =

Jarak yang digerakan oleh pelarut

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu :


1) Pelarut disebabkan pentingnya koefisien partisi, rnaka perubahan-

perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat

menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.

2) Suhu.Perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga

kecepatan aliran.

3) Ukuran dari bejana. Volume dari bejana mempenyaruhi homogenitas

dari atmosfer jadi mernpengaruhi kecepatan penguapan dari

komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan,

ada tendensi perambat lebih lama, seperti perubahan-perubahan

komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan

berttbah juga. Dua faktor yaitu penguapan clan kornposisi

mempe-ngaruhi harga Rf.

4) Kertas. Pengaruh utama kertas pada harga-harga Rf timbul dari

perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam

kertas. Kertas-kertas mempengaruhi kecepatan aliran dan akan

mempengaruhi pada kesetimbangan partisi.

5) Sifat dari rantpuran. Berbagai senyawa mengalami partisi di an-

tara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak.

Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan

satu terhadap lainnya hingga terhadap harga-harga Rf.

Untuk mengukur Rf perlu melokalisir permukaan pelarut. Harga-harga

Rf biasanya dinyatakan sebagai fraksi/bagian. Perbedaan dalam

harga-harga Rf untuk dua senyawa yang dipisahkan tergantung pada

besarnya noda-noda dan panjangnya aliran terlarut. Cara yang paling

mudah dalam pengukuran Rf adalah dengan menggunakan mistar.

Ujung nol ditempatkan pada titik mula-mula dan ujung yang lain

direntangkan ke arah permukaan pelarut dan harga Rf langsung dapat

dibaca pada titik di mana angka mistar tepat pada noda. Dalam

penentuan Rf perlu mengukur dari pusat pita atau noda.

Biasanya identifikasi dari senyawa yang tak diketahui dilakukan

pemisahan berulang. Daerah yang mengandung senyawa yang tak

diketahui dipotong dan senyawa dielusi dengan pelarut yang sesuai.

Bila hanya diperoleh satu noda dengan menggunakan lebih dari satu


pelarut dengan menunjuk senyawa yang sama maka dapat diambil

kesimpulan bahwa kemungkinan keduanya adalah identik

Cara lain untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa yaitu dengan

reaksi-reaksi warna yang karakteristik. Reaksi kebanyakan sangat

berguna dalam pemisahan senyawa-senyawa anorganik, tetapi untuk

senyawa organik sangat kecil kejadiannya, karena kebanyakan

konstituen-konstituen dari campuran mempunyai sifat-sifat kimia yang

mirip.

1.2. Menyiapkan Sampel dan Standar untuk Kromatografi Lapis Tipis

a. Sampel dipersiapkan sama seperti preparasi sampel untuk

kromatografi kertas, yaitu sampel padat dilarutkan dengan pelarut

organik atau diekstraksi.

b. Perlu membuat plat kromatografi, yaitu untuk membentangkan

penyerap dalam palisan tipis yang berguna sebagai penyokong

yang inert. Penyerap padat berbentuk bubuk halus dibuat

menjadi bubur (slury) dengan air (kurang umum dengan zat cair

organik yang mudah menguap) dan dibentangkan di atas plat gelas.

Pembuatan lapisan tipis di atas kaca ada beberapa cara yaitu

dengan jalan menyemprotkan atau pencelupan, di samping

dikerjakan dengan tangan dapat juga dengan mesin. Plat yang telah

dilapisi dipanaskan atau di-"aktif'"-kan dengan jalan memanaskan

pada suhu kira-kira 100°C selama beberapa waktu lamanya.

Larutan cuplikan dalam pelarut yang mudah menguap diletakkan di

atas lapisan dengan menggunakan pipet atau alat penyuntik.

c. Waktu rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang 10

cm pada silika gel adalah sekitar 20 - 30 menit (tergantung dari sifat

fasa bergerak), sedangkan pemisahan yang sama dengan

memerlukan waktu dua jam. Untuk pemisahan-pemisahan secara

kualitatif pada plat yang kecil memerlukan waktu sekitar 5 menit.

d. Hasil pemisahan yang baik ternyata bahwa penyerap dalam

kromatografi lapisan tipis mempunyai kapasitas yang lebih besar

bila dibandingkan dengan kertas. Keuntungan dari sistem serapan


ialah dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang

sifatnya hidrofobi, seperti lipida-lipida dan hidrokarbon. Pemisahan

dengan lapisan tipis banyak digunakan dalam kimia organik dan

beberapa dalam kimia anorganik.

e. Pembuatan Lapisan Tipis

Penyerap dibentangkan di atas permukaan plat kaca. Untuk

pemisahan secara kualitatif yang cepat sering digunakan gelas

mikroskop (microscope slide). Kebanyakan alat-alat digunakan

dalam bentuk plat kaca dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm,

dua ukuran ini dianggap sebagai "standard" dan permukaan dari

plat harus rata.

Flat-plat kaca sebelum dipakai dicuci dulu menggunakan detergent

kemudian dikeringkan. Pencucian terakhir dapat memakai aseton

(jika perlu). Suatu hal yang perlu diperhatikan jangan menyentuh

permukaan dari plat yang bersih dengan jari-jari.

f. Pada dasarnya ada empat cara yang digunakan dalam pembuatan

lapisan tipis, yaitu pembentangan, penuangan, penyemprotan dan

pencelupan. Metoda-pembentangan dan penyernprotan dapat dikerjakan

dengan tangan atau dengan alat. Banyak pemakai yang tak

menggunakan metoda penuangan secara mekanik. Jika penyerap

sangat halus dan partikel-partikelnya homogen, dan jika tak

menggunakan pengikat, maka bubur dapat dituangkan di atas plat dan

dibiarkan hingga melapisinya. Pembuatan dengan penuangan biasanya

mudah dengan menggunakan jenis alumina, dan pembuatan buburnya

tidak menggunakan air, melainkan menggunakan cairan yang mudah

menguap seperti etanol (atau campuran etanol-air) atau etil asetat.

g. Pencelupan. Plat-plat yang kecil, seperti gelas mikroskop, dapat dilapisi

dengan pencelupan dalam bubur dari penyerap dalam kloroform atau zat

cair mudah menguap yang lain. Sekali lagi lebal lapisan yang pasti tidak

diketahui dan kemungkinan lapisan tak dapat dibuat dengan baik,


meskipun demikian metoda ini cukup memuaskan untuk membuat

sejumlah dari plat-plat untuk pemisahan secara kualitatif dengan cepat.

Setelah pembentangan plat dibiarkan kering selama kira-kira 5 -10

menit, ini bila dibuat dengan bubur yang berair, selanjutnya dipanaskan

dan di"aktif"kan dengan pemanasan pada suhu kira-kira 100°C selama

30 menit. Plat-plat yang dibuat dengan zat-zat cair organik yang mudah

menguap tak perlu pemanasan lebih lanjut. Penyentuhan dengan jari-jari

akan merusak lapisan dan melepaskan partikel-partikel dari permukaan.

h. Fasa Bergerak dan Penempatan Cuplikan

Pemilihan fasa bergerak tergantung pada faktor-faktor seperti dalarn

pemisahan dalam kromatografi kolom serapan. Sebaiknya menggunakan

campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin,

karena dapat mengurangi serapan dari setiap komponen dari campuran

pelarut. Jika komponen-kornponen yang mempunyai sifat polar tinggi

(terutama air) dalam campuran akan merubah sistem menjadi sistem

partisi. Campuran yang baik memberikan fasa-fasa bergerak yang

mernpunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya tidak

mencampur lebih dari dua komponen, karena campuran yang lebih

kompleks cepat mengalami perubahan-perubahan fasa terhadap

perubahan suhu. Kemurnian dari pelarut adalah lebih penting dalarn

lapisan tipis daripada bentuk-bentuk kromatografi lain, karena

digunakan sejumlah materi yang sedikit.

Cara menempatkan cuplikan pada lapisan tipis seperti cara-cara yang

digunakan pada kromatografi kertas, yaitu dengan pipa kapiler atau

mikro pipet. Pada penempatan cuplikan ujung penetes dapat mengenai

permukaan lapisan, meskipun demikian harus diusahakan sedekat

mungkin. Pelarut cuplikan merupakan pelarut yang mudah menguap dan

mempunyai polaritas yang rendah.

Kedudukan noda tak dapat diberi tanda dengan pensil, seperti dikerjakan

pada kertas, penunjuk noda dapat digunakan misal dengan penggaris

yang diletakkan di samping plat kaca. Penempatan noda di atas plat

kira-kira 1 cm dari salah satu ujungnya di mana ujung ini nanti


dicelupkan dalam pelarut. Untuk plat kaca yang mempunyai ukuran 20 x

20 cm, penempatan noda-noda kira-kira 1,5 cm dari ujung bawah dan

dimulai clan diakhiri kira-kira 0,5 cm dari samping kaca dan noda-noda

diteteskan masing-masing pada jarak kira-kira 1 cm dari masing-masing

pusat noda. Untuk pekerjaan pemisahan yang besar penempatan noda

dapat diteteskan hingga membentuk garis, lihat gambar 6.

Gambar 6. Plat Kaca Kromatografi Lapisan Tipis, Ukuran 20 x 20 cm

untuk Kromatografi Penaikan Satu Arah

Garis awal diberi tanda pada ujung dari plat dengan pensil dan garis akhir

dapat dibuat di bagian atas dengan menggoreskan pensil, yang

menyebabkan goresan dari aliran pelarut akan ditahan bila permukaan

pelarut sampai pada garis. Jangan terlalu lama mencelupkan plat dalam

bejana bila permukaan pelarut telah mencapai garis akhir, karena oleh

pengaruh difusi dan penguapan dapat menyebabkan pemancaran dari

noda-noda yang terpisah. Ujung plat yang dicelupkan dalam fasa bergerak

jangan dibiarkan hingga rusak. Bila akan dilakukan pemisahan dua jalan,

maka lapisan dari dua sisi yang berdekatan tidak perlu dihilangkan.

i. Pengembangan Kromatografi dan Lokasi

Bila plat kromatografi telah disiapkan dan cuplikan telah ditempatkan di

atasnya, kemudian dimasukkan dalarn bejana yang cocok dengan ujung

yang paling bawah, di mana cuplikan ditempatkan, dicelupkan dalam fasa

bergerak yang telah dipilih sedalam kira-kira 0,5 - 1,0 cm. Biasanya dua

plat dapat dimasukkan dalam bejana, dalam hal ini akan diperoleh

kromatografi penaikkan. Bejana diusahakan jangan sampai bocor.

Sering tidak rnemerlukan waktu kesetimbangan, tetapi untuk meyakinkan

homogenitas dari atmosfer dalam bejana, maka dinding dalam bejana

dapat dilapisi dengan lembaran kertas saring yang ujungnya direndam

dalam fasa bergerak. Sedapat mungkin menggunakan bejana yang kecil


sehingga atmosfer di dalam bejana mempunyai volume sekecil mungkin.

Untuk plat kaca yang kecil, microscope slide, sebagai bejana dapat dipakai

gelas piala yang mempunyai kapasitas sekitar 500 ml, juga dinding sebelah

dalamnya dapat dilapisi dengan kertas saring yang ujungnya dicelupkan

dalam fasa bergerak.

Permukaan pelarut yang terdapat di dalam jangan sampai berhubungan

dengan atmosfer luar, karena dapat mengakibatkan komponen-komponen

yang mudah menguap. Kalau dikehendaki perkembangan dengan jenis

penurunan atau mendatar, maka alat yang digunakan menjadi agak sukar.

Misal menghendaki perkembangan jenis penurunan, maka tempat fasa

bergerak ditempatkan di bagian atas dari bejana. Dan untuk mengalirkan

pelarut ke tempat plat diperlukan perantara yang dapat berupa kapas atau

gulungan kertas lihat gambar 7.

a. Tempat pelarut

b. Gulungan kertas

c. Lapisan kromatografi

Gambar 7. Kromatografi Lapisan Tipis Jenis Penurunan.

Setelah pengembangan, plat diambil dari bejana dan dibiarkan kering tanpa

pemanasan. Bila diperlukan, aliran udara dapat digunakan dan diarahkan

pada permukaan yang mendatar. Seperti dalam kromatografi kertas, dalam

pemisahan dua jalan, maka pelarut yang pertama harus hilang sebelum

pemisahan/pengembangan berikutnya.

Pada umumnya metoda lokasi dari senyawa tak berwarna pada lapisan

tipis adalah mirip seperti dikerjakan dalam kromatografi kertas. Metoda-

metoda fisika yang sering digunakan meliputi fluoresensi sinar ultra ungu

dan pencacahan radioaktif. Jika pereaksi kimia digunakan untuk lokasi,

maka dapat dilakukan dengan penyemprotan dan tidak dengan pencelupan


seperti diutarakan pada kromatografi kertas. Senyawa-senyawa organik

dapat dilokasi dengan penyemprotan menggunakan asam sulfat pekat

kemudian dipanaskan pada suhu sekitar 200°C selama lebih kurang

sepuluh menit. Noda dari senyawa akan menjadi hitam. Ini merupakan cara

lokasi yang efektif, tetapi sedikit meinberikan pertolongan dalam

identifikasi. Pereaksi lokasi yang lain untuk senyawa organik adalah Iod.

Plat kaca yang mengandung noda-noda dibiarkan terkena uap Yod, yaitu

dengan jalan meletakkan plat dalam bejana atau gelas piala yang tertutup

yang berisi kristal Iod untuk beberapa saat lamanya. Warna dari bejana

akan menjadi ungu, untuk senyawa-senyawa tak jenuh akan memberikan

noda-noda yang tak berwarna, tetapi banyak senyawa organik yang jenuh

akan menimbulkan noda-noda yang berwarna coklat. Semua warna ini

akan cepat hilang dibiarkan diatmosfer.

j. Identifikasi dan Harga-harga Rf

Identifikasi dari snyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik

dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna.

Untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam

lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya

pada kertas harga Rf didefinisikan sebagai berikut:

Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal Harga Rf = Jarak yang digerakkan oleh palarut dari titik asal

Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan

harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang

diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang

digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran

dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.

Pengukuran lain yang sering dipakai adalah menggunakan pengertian Rx

atau Rstd yang didefinisikan sebagai berikut :

Jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tak diketahui Rx atau Rstd =

Jarak yang digerakkan oleh senyawa standard yang diketahui


Senyawa standard biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan

senyawa yang dipisahkan pada kromatogram. Misal perbandingan suatu

hidrolisa protein dengan glisin atau alanin.

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi

lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf adalah :

1) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2) Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.(Biasanya aktifitas dicapai

dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-

molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap).

Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar

terhadap harga Rf meskipun menggunakan fasa bergerak dan solute

yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,

jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan

jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.

3) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, dalam prakteknya tebal

lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal

lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut

menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

4) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak. Kemurnian dari

pelarut yang digunakan sebagai fasa bergerak dalam kromatografi

lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut

digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul

diperhatikan.

5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang

digunakan.

6) Teknik percobaan.

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang

hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun

teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).

7) Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil

penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan


efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan

kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.

8) S u h u. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu

tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam

komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-

perubahan fasa.

9) Kesetimbangan.

Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting

dalarn kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer

dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer

dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut

campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut

yang berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat pada bagian

tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.

1.3. Menyiapkan sampel dan Standar untuk Kromatografi Serapan/ Kolom a. Sampel dipersiapkan sama dengan preparasi sampel untuk

kromatografi kertas, yaitu bila sampel padat diekstaksi terlebih dahulu.

b. Penyiapan pelarut atau pemilihan dari pelarut tergantung dari sifat

kelarutannya. Tetapi lebih baik untuk memilih suatu pelarut yang tak

tergantung pada kekuatan elusi, sehingga zat-zat elusi yang lebih

kuat dapat dicoba. "Kekuatan" dari zat elusi adalah daya penyerapan

pada penyerap dalam kolom. Biasanya untuk penyerap-penyerap

yang polar seperti alumina dan silika gel, maka kekuatan penyerapan

naik dengan kenaikan polaritas dari zat yang diserap.

Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deret-deret pelarut untuk

senyawwa-senyawa dengan menggunakan silika gel akan diturunkan

dalam urutan sebagai berikut :

air murni < metanol < etsnol < propanol < aseton < etil-asetat <

dietileter < kloroform < rnetilena klorida < benzena < toluena <

trikloroetilena < karbon tetraklorida < sikloheksana < heksana.


Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS, pada

karbon aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarid

diturunkan dalam urutan :

etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol <

air murni.

Urutan ini adalah dari kenaikan polaritas atau penurunan panjang

rantai dari homolog. Sedangkan untuk alumina dan silika gel

urutannya adalah sebaliknya. Kemurnian dari pelarut-pelarut harus

setinggi mungkin.

c. Penyiapan penyerap

Penyerap yang sering digunakan adalah alumina. Suatu pengertian

yang digunakan dalam hubungannya dengan penyerap-penyerap

adalah "aktifasi". Kadang-kadang dihubungkan dengan luas

permukaan spesifik dari zat padat, yaitu luas permukaan yang diukur

dalam meter persegi tiap gram, dalam hal karbon, silika gel dan

alumina dapat dibuat menjadi aktif dengan memiliki permukaan

spesifik beratus-ratus meter persegi. Sedangkan seperti kalsium,

karbonat dan kalsium hidroksida, mempunyai permukaan spesifik

yang mempunyai ukuran dalam puluhan meter persegi atau kurang

sampai dikategorikan relatif tak aktif.

Banyak zat-zat padat yang telah digunakan sebagai penyerap,

diantaranya adalah sebagai berikut :

Zat padat Digunakan untuk memisahkan

Alumina/magnesia

Silika gel

Karbon

Magnesium silikat Magnesium karbonat

Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester, alkaloid-alkaloid, senyawa-senyawa anorganik.

sterol-sterol, asam-asam amino.

Peptida-peptida, karbohidrat-karbohidrat, asam-asam amino

Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-

alkaloida Porphirin,Karotenoida-karotenoida

Karotenoida-karotenoida, xantofil


Kalsium hidroksida Kalsium karbonat Kalsium fosfat Aluminium silikat

Enzim-enzim, protein-protein, polinukleotida-polinukleotida

Sterol-sterol Enzim-enzim Klorofil- Klorofil

Banyak penyerap seperti alumina, silika gel, karbon aktif dan

magnesium silikat dapat diperoleh diperdagangan. Penyerap tersebut

sering memerlukan aktivasi sebelum dipakai, hal ini dapat dilakukan

dengan pemanasan dan mungkin dengan pengurangan tekanan.

Suhu optimum untuk aktivasi aluminium biasanya sekitar 400°C dan

waktu pemanasan cukup selama 4 jam. Untuk kebanyakan zat-zat

padat, pemanasan pada suhu 200°C selama 2 jam.

Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi

kolom sering merupakan katalisator yang baik; ini rnerupakan bahaya

yang perlu mendapat perhatian. Alumina sering menimbulkan

perubahan-perubahan kimia dan menimbulkan reaksi-reaksi misal

dapat menyebabkan kondensasi dari aldehida-aldehida dan keton-

keton, sehingga bila hal ini terjadi, maka harus menggunakan alumina

yang bersifat netral. Silika gel dapat menyebabkan isomerisasi dari

berbagai senyawa-senyawa seperti terpen dan sterol.

d. Kolom Partisi

Didalam kromatografi partisi, penyerap zat padat diganti dengan fasa

tetap zat cair, yang biasanya hanya sebagian dapat bercampur

dengan zat cair yang mengalir sebagai fasa bergerak. Zat yang

dilarutkan (solute) akan didistribusikan dengan sendirinya diantara

dua fasa zat cair (tetap dan bergerak) sesuai dengan koefisien

partisinya. Disebabkan perbedaan-perbedaan dalam koeffisien partisi

dari berbagai komponen, maka campuran akan terpisah dengan cara

yang sama seperti pada sistem-sistem penyerap.

d. Fasa tetap harus disokong dalarn beberapa cara, yaitu fasa tetap zat

cair disokong pada zat padat yang bersifat inert terhadap senyawa-

senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang menyokong ini


ditempatkan dalam kolom seperti pada kromatografi serapan.

Kenyataan sangat kecil sekali perbedaan antara dua macam jenis

kromatografi ini. Zat yang menyokong harus penyerap dan menahan

fasa tetap dan harus membuat luas permukaannya menjadi seluas

mungkin untuk fasa yang mengalir. la harus stabil, mudah diisikan

dalam kolom bila menyerap fasa tetap zat cair dan harus tidak

merintangi aliran pelarut. Fasa bergerak dalam kromatografi partisi

dapat berupa zat cair atau gas. Hal hal yang perlu diperhatikan dalam

kolom partisi adalah :

(1) Zat-zat padat penyokong

Zat-zat penyokong yang digunakan kebanyakan ialah silika gel, bubuk

selulosa dan tanah diatome (kieselguhr, celit dan sebagainya) zat

padat lainnya seperti pati hanya digunakan secara terbatas. Silika gel

hampir selalu digunakan dengan air atau larutan berair sebagai bufer

sebagai fasa tetap. Jumlah zat cair yang digunakan kira-kira 0,6 ml

untuk setiap gram silika gel.

(2) Peralatan

Kolom dan alat-alat lain yang digunakan untuk kromatografi partisi

adalah sama seperti yang digunakan dalam kromatografi serapan.

Tabung-tabung yang digunakan di laboratorium panjangnya antara 25

- 50 cm dengan diameter hingga 4 cm. Aliran pelarut yang melalui

kolom partisi mempunyai tendensi agak lambat tetapi dapat

dipercepat dengan menggunakan tekanan udara di atas kolom seperti

halnya pada kolom serapan.

(3) Cara memasukkan penyerap

Pengisian penyerap dalam kolom adalah sangat penting seperti dalam

kromatografi serapan. Pertama mencampur penyokong dengan fasa

tetap diaduk dengan sejumlah fasa bergerak yang digunakan. Bubur

ini kemudian dituangkan sedikit demi sedikit dalam tabung yang

mengandung sedikit zat cair yang sama. Setiap pemasukan

bubur ke dalam tabung disertai dengan penekanan dengan

http://mengalir.la/


batang gelas yang ujungnya datar sedikit lebih kecil daripada

diameter tabung. Kelebihan dari pelarut dapat dibiarkan hingga

lepas melalui kolom atau diambil dengan pipet. Berhasilnya

pemisahan tergantung pada kekompakan pengisian dan

keteraturan pita-pita kromatografi.

(4) Pemasukan Cuplikan

Pemasukan cuplikan adalah menggunakan pipet seperti

dilakukan pada kolom serapan. Mula-mula melarutkan cuplikan

dalam sejumlah fasa bergerak dan mencampurkan dengan

sejumlah zat padat penyokong hingga diperoleh bubuk yang

kering. Bubuk ini kemudian diletakkan di atas kolom dan sedikit

fasa bergerak ditambahkan.

(5) Elusi

Teknik elusi yang digunakan dalam kolom partisi adalah sama

seperti yang di gunakan dalam kolom serapan. Jika fasa tetap

adalah berair, maka fasa bergerak yang digunakan zat cair

organik atau campuran. Jika penyokong yang digunakan tak

suka air, maka fasa tetap berupa zat organik dan fasa bergerak

berair adalah menjadi mungkin. Ini dikenal sebagai kromatografi

“fasa berbalik” dan telah digunakan untuk memisahkan

senyawa-senyawa yang sangat larut dalam pelarut-pelarut

organik.

Tabel 2. Contoh Beberapa Pemisahan pada Kolom Partisi

Pemisahan Penyokong Fase tetap

Fase bergerak

Alkolurl-alkohol C1-C4

Asanrasam lemak Cz-C8

Atam-asam amina

Fenol-fenol

Lipida-lipida

Calite

Silica gel

Pati

Selulosa

Silica gel

Air

Air

Air

Air

Air

CHCl3 atau CCl4

CHCl3/n-BuoH

n-ProH atau n-

BaOH/HCl

MeOH/n-

BaOH/CHCl3


Bermacam-macam

2. LEMBAR KEJA

I. LEMBAR KERJA : KROMATOGRAFI KOLOM

Acara : Menetapkan zat warna di dalam sampel dengan khromatografi kolom.

Tujuan : Melakukan penetapan zat warna dengan menggunakan khromatografi

kolom

Alat :

Beaker glas

Batang pengaduk

Mortal dan martil

Corong

Kolom

Erlenmeyer kecil

Bahan :

Minuman/makanan/daun-daunan/bunga yang berwarna.

CaCO3

n- Hexan

Etanol

Kertas saring

Glass woll/kapas

Cara Kerja :

A. Penyiapan sampel :

1. Sampel/daun/wortel di ekstrak dengan pelarut organic (etanol atau n-Hexan).

2. Ekstrak disaring dengan kapas atau kertas saring, filtratnya diuapkan hingga

diperoleh larutan yang pekat (Jangan sampai kering).

B. Penyiapan kolom dan pembuatan penyerap.

1. Masukkan glass woll atau kapas ke dalam kolom hingga bagian bawah,

2. Masukkan serbuk CaCO3 perlahan-lahan hingga merata sampai 1/3 isi kolom,

atau serbuk CaCO3 dilarutkan dahulu dalam pelarut organik (Petroleum eter)

hingga diperoleh bubur.


3. Tuangkan bubur CaCO3 ke dalam kolom sampai 1/3 dari panjang kolom.

4. Beri kertas saring berbentuk bulatan diatas permukaan penyerap.

5. Teteskan larutan sampel (A) ke dalam kolom penyerap dengan menggunakan

pipet, berikut tambahkan pelarut, dan jaga jangan sampai di atas permukaan

penyerap kering.

6. Tunggu beberapa lama sampai diperoleh pita-pita yang berwarna terpisah.

7. Amati warna pita-pita yang terbentuk dan tuliskan warna apa yang terpisah

tersebut.

II. LEMBAR KERJA : KROMATOGRAFI KERTAS

Acara : Penetapan zat warna yang terdapat dalam bahan dengan khrometografi

kertas menaik.

Tujuan : Melakukan penetapan zat pewarna yang terdapat dalam

ninuman/makanan/ekstrak daun dll.

Alat :

Gelas piala

Hot palte

Bejana kromatografi

Kertas kromatografi

Mikropipet

Mortar dan matil

Corong gelas

Cawan penguap

Kertas saring

Bahan :

Asam asetat

Aquadest

Etanol 50%

Aseton

Hexan


Minuman fanta (merah), the botol, jelly, jenis daun (Hijau), kembang gula.

Cara Kerja :

A. Mempersiapkan sampel :

1. Minuman teh botol/minuman ringan ditambah asam asetat hingga bereksi

asam.

2. Untuk kembang gula larutkan dalan aquadest dan asam asetat.

B. Mempersiapkan kertas kromatografi :

1. Potong kertas kromatografi dengan panjang dan lebar tertentu sesuai dengan

bejana kromatografi.

2. Buatlah garis dengan pinsil pada kertas khromatografi, sejajar dengan sisi

kertas bagian bawah dan berjarak 2 cm.

3. Pada garis tersebut buatlah noda atau bercak dengan mikro pipet atau jarum

injek, dan totolkan berturut-turut untuk masing-masing sampel dengan jarak 2

cm.

4. Sebelum kertas dimasukkan ke dalam bejana, bejana tersebut harus

dijenuhkan dahulu dengan uap pelarut.

5. Gantungkan kertas tersebut dalam bejana kromatografi dan tutuplah sampai

bejana jenuh dengan uap pelarut, kemudian celupkan kertas sampai tercelup

setinggi 1 cm

6. Setelah pelarut menaik sampai jarak tertentu dari tempat noda, keluarkan

kertas dan berilah tanda dengan pensil, kemudian keringkan (diangin-

anginkan).

7. Bandingkan noda sampel terhadap noda standar atau pembanding dan hitung

Rfnya.

3. EVALUASI

1. Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS, pada

karbon aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarid

diturunkan dalam urutan :


a. etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < air

murni

b. air murni < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < asam

asetat

c. dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol

d. aseton < etanol < rnetanol < asam asetat< air murni < dietil eter

e. air murni < dietil eter< rnetanol < asam asetat

2. Jika fasa tetap adalah air, maka fasa gerak yang digunakan

adalah : ...

a. Zat padat.

b. Zat cair organik

c. Zat cair

d. Larutan

e. Gas

3. Zat-zat penyokong yang sering digunakan dalam kromatografi kolom

adalah :...

a. Pasir, pati dan glas woll

b. Gula pasir, pati, dan sliika gel

c. Silika gel, bubuk selulosa dan tanah diatome

d. Pasir, tepung, dan pati

e. Silika gel, tepung dan gula

4. Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi kolom

adalah merupakan :

a. Reduktor

b. Kopaktor

c. Stabilisator

d. Katalisator

e. Oksidator

5. Silika gel merupakan zat padat yang digunakan sebagai penyerap, dalam

kromatografi kolom yaitu untuk memisahkan : ...


a. Karotenoid, sterol

b. Porphirin, karotenoid

c. Sterol-sterol, asam-asam amino

d. Enzim, protein, sterol

e. Enzim, pitamin dan sterol

6. Suhu optimum untuk aktivasi aluminium biasanya sekitar :...

a. 400°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam.

b. 400°C dan waktu pemanasan cukup selama 1 jam

c. 200°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam

d. 600°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam

e. 200°C dan waktu pemanasan cukup selama 1 jam

7. Salah satu cara untuk pembuatan noda pada kromatografi kertas adalah dengan

menggunakan :...

a. Gelas kapiler dengan diameter yang sama

b. Alat penyuntik dan gelas kapiler dengan diameter yang sama

c. Batang pengaduk dari gelas

d. Sendok atau batang dari kayu

e. Alat berupa kawat.

8. Dalam mengidentifikasi noda-noda dalam kertas dapat menggunakan harga Rf

(retordation factoryang) yang didefinisikan sebagai :...

a. Perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh pelarut terhadap jarak yang

digerakkan oleh senyawa.

b. Jarak pelarut dan senyawa sama-sama bergerak ke satu arah

c. Perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh senyawa terhadap jarak

yang digerakkan oleh pelarut.

d. Pelarut digerakkan ke arah yang samping dan pembawa digrakkan ke arah

atas.

e. Persentase dari Perbandingan antara pelarut dan pembawa

9. Kertas sebagai fasa diam dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari

gula sederhana, yaitu :...


a. Sukrosa

b. Maltosa

c. Galaktosa

d. Fruktosa

e. Glukosa

10. Perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat

menyebabkan :...

a. Perubahan harga Rf.

b. Harga Rf sama dengan nol

c. Perubahan fasa gerak dan fasa diam

d. Harga Rf tidak terdeteksi

e. Perubahan jarak noda

b. Soal Essay

1. Jelaskan 3 faktor yang menentukan harga Rf pada kromatografi kertas!

2. Jika salah satu komponen dari campuran bergerak 10,8 cm dari garis dasar,

sedangkan pelarut bergerak sejauh 13,6 cm, hitunglah harga Rf untuk komponen

tersebut!

3. Jelaskan hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemisahan dengan kromatografi

kertas!

4. Tuliskan struktur kimia dari selulosa!

5. Mengapa penetesan larutan sampel pada kertas kromatografi tidak boleh terlalu

banyak. Jelaskan!

6. Sebutkan 5 jenis zat penyokong yang sering digunakan dalam kolom partisi!

7. Zat padat Alumina/magnesia yang digunakan sebagai penyerap

digunakan untuk memisahkan :...

8. Jelaskan urutan kekuatan elusi menurut TRAPPE dari deret-deret pelarut

untuk senyawwa-senyawa dengan menggunakan silika gel!

9. Jelaskan teknik elusi yang digunakan dalam kolom partisi!

10. Jelaskan bagaimana cara pembuatan lapisan tipis di atas kaca pada

kromatografi lapis tipis!

11. jelaskan apa yang dimaksud dengan Rx atau Rstd


12. jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi

lapisan tipis yang juga dapat mempengaruhi harga Rf !

13. Jelaskan cara-cara yang digunakan dalam pembuatan lapisan tipis!

14. Zat padat kieselguhr adalah sebagai zat penyerap untuk kromatografi lapis

tipis yang digunakan untuk memisahkan :...

C. KEGIATAN PEMBELAJARAN 3. MELAKSANAKAN PEMISAHAN KROMATOGRAFI

1. LEMBAR INFORMASI

Cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap,

yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat

maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan (absorption

chromatography), dan jika zaf cair dikenal sebagai kromatografi partisi

(partition chromatography). Karena fasa gerak dapat berupa zat cair atau gas

maka semua ada empat macam sistem kromatografi. Keempat rnacam sistem

kromatografi tersebut adalah :

1). Fasa gerak zat cair - fasa tetap padat : Komatografi penukar ion.

2). Fasa gerak gas - fasa tetap padat : Kromatografi gas padat

3). Fasa gerak zat cair - fasa tetap zat cair, dikenal sebagai

kromatografi partisi dan kromatografi kertas.


4). Fasa gerak gas - fasa tetap zat cair : Kromatografi gas-air dan

Kromatografi kolom kapiler.

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada senyawa-

senyawa yang dipisahkan, sehingga terdistribusi sendiri diantara fasa

gerak dan fasa tetap dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda

dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain.

a. Kromatografi Partisi

Perbedaan yang pokok adalah terletak pada sifat dari penyerap, dimana

dalam kromatografi partisi berupa materi yang berpori, seperti

kieselguhr, yang dilapisi dengan lapisan dari zat ca ir sering

menggunakan air. Fasa tetap adalah lapisan zat cair dan zat padat yang

berperan sebagai penyangga/penyokong. Jika fasa-fasa bergerak dan

tetap keduanya berupa zat cair maka akan diperoleh kromatografi zat

cair-cair.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran tidak

tergantung pada kelarutannya dalam fasa tetap, yang berupa zat cair

sehingga senyawa-senyawa yang lebih larut akan bergerak lebih lambat

turunnya dalam kolom daripada yang kurang kelarutannya. Selama

bergerak senyawa-senaywa mengalami partisi di antara dua fasa, dan

pemisahan terjadi karena perbedaan dalam koefisien partisi.

Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, dimana lembaran

kertas adalah sebagai pengisi/pengganti dari kolom. Kromatografi

campuran dari senyawa yang dipisahkan membentuk suatu jalur dalam

kolom.

b. Teknik-teknik Pemisahan

Untuk memperoleh pemisahan dari jalur-jafur komponen harus

dikerjakan lebih lanjut dengan melakukan satu dari tiga macam cara:

analisa elusi, analisa frontal atau analisa perpindahan gerakan.


I). Analisa elusi

Analisa elusi digunakan secara ekstensif dalam kromatografi partisi.

Dalam elusi aliran dari fasa bergerak (eluting agent) adalah terus

menerus hingga campuran terpisah sempurna menjadi komponen-

komponennya. Harus diperhatikan bahwa fasa bergerak yang dipilih

harus tidak mempunyai efek terhadap fasa tetap atau hanya sangat

lemah diserap olehnya.

Pengaliran pelarut secara terus menerus melalui kolom disebut elusi.

Elusi bisa dilakukan dengan memanfaatkan gaya gravitasi, gaya

kapiler, atau tekanan mekanis. Selama proses elusi berlangsung, spesi

sampel bisa berada didalam fasa gerak (berarti ikut mengalir) atau

berinteraksi dengan fasa diam (berarti tidak bergerak). Tiap molekul

satu jenis spesi akan bergantian masuk dan keluar fasa diam

dengan perbandingan waktu yang sama dan menghasilkan gerakan

kelompok yang sama. Waktu pergerakan spesi adalah waktu yang

dihabiskan oleh spesi ketika molekul spesi berada dalam fasa gerak.

Karena tiap spesi memiliki perbandingan waktu yang khas untuk

berada dalam fasa gerak (ketika tidak berinteraksi dengan fasa diam),

maka terjadi pemisahan kelompok-kelompok spesi.

Elusi pertama-tama telah digunakan oleh TSWETT tahun 1903 untuk

pemisahan pigmen-pigmen daun, karena adanya warna maka cepat

terlihat lokasinya dalam kolom. Senyawa-senyawa tak berwarna dapat

juga dilihat lokasinya, karena flouresensi dalam sinar ultra -violet. Sekali

pemisahan terjadi pita komponen dapat diambil dengan jalan memotong

dari bagian-bagian yang mengandung berbagai komponen, kemudian

diekstrak dengan pelarut yang sesuai. Cara lain, aliran dari zat

pengelusi dapat diteruskan hingga tiap-tiap komponen tercuci sempurna

dari kolom. Untuk mengetahui tiap-tiap komponen dapat dideteksi

dengan menggunakan pereaksi kimia yang cocok atau test fisika.

Ekor (tailing)yaitu kejadian yang selalu terjadi dalam kromatografi

serapan bila teknik elusi yang digunakan tidak sesuai. Ekor menaikkan


kelebaran dari pita-pita hingga ada tendensi untuk menimbulkan

penindihan pita satu dengan pita lainnya (overlap).

2). Analisa Frontal

Di dalam analisa frontal, larutan campuran ditambahkan terus menerus

hingga kolom jenuh. Larutan yang keluar dari kolom sebelah bawah

diukur terus menerus. Sebagai contoh, campuran yang mengandung

tiga komponen A, B, dan C. Anggaplah bahwa komponen A yang paling

lemah diserap oleh penyerap dalam kolom, sedang komponen C yang

paling kuat diserap dan komponen B lebih kuat daripada A tetapi lebih

lemah diserap daripada C. Bila campuran ditambahkan terus menerus

maka A akan mempunyai tendensi keluar paling dahulu daripada yang

lainnya dan pada tingkat pertama akan diperoleh A yang murni.

Komponen B lebih kuat diserap daripada A dan lebih lemah daripada C,

hingga ia akan bergerak yang tak akan mendahului A. Pada langkah

kedua akan diperoleh terutama B tetapi tercampur dengan A karena

pemasukan yang terus nienerus dari carnpuran. Sedangkan pada

langkah ketiga akan terdiri atas campuran asal A + B + C. Dalam cara

ini hanya pada langkah pertama akan diperoleh kornponen yang murni.

Pemisahan secara sempurna tidak dapat diperoleh.

3) Analisa perpindahan gerakan

Analisa perpindahan gerakan mungkin dapat dipandang sebagai hibrida

dari analisa elusi dan frontal, seperti dalam metode elusi, sejumlah kecil

dari campuran diletakan di atas kolom, kemudian larutan senyawa yang

lebih kuat diserap daripada setiap komponen dari campuran

ditambahkan terus menerus dari atas kolom. Senyawa ini dikenal

sebagai pengganti (displacer). Campuran kemudian bergerak ke bawah

pada kecepatan yang sama seperti pengganti yang ditambahkan dan

campuran akan terpisah sendiri menjadi pita-pita dari komponen-

komponen yang murni, urutan dari pita-pita merupakan urutan dari

kekuatan penyerapan pada penyerap. Tiap-tiap pita murni bekerja

sebagai pengganti untuk komponen-komponen yang mendahuluinya dan


pita yang paling akhir merupakan pita yang paling kuat diserap akan

didorong oleh pengganti.

c. Kromatografi padat-gas (Gas Solid Cromatography, GSC).

Kromatografi Gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat yang

mudah menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu fasa diam

(stationary phase). Dasar kerja dari GSC adalah adsorbsi (serapan). Dengan

alasan ini maka GSC sangat sukar untuk digunakan secara berulang dengan

hasil yang sama. Hal ini disebabkan oleh kenyataan-kenyataan bahwa :

1. Aktivitas dari penyerap (adsorbent) tergantung pada cara pembuatannya.

2. Juga aktivitas tergantung pada bagaimana ia diperlakukan setelah

pembuatannya.

Keadaan 1 dan 2 sangat sukar untuk distandarisasi. Hal-hal inilah yang

menyebabkan "Reproducibility" yang rendah dari GSC. Yang sering dijumpai

adalah :

1. Puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak homogen

dari penyerap.

2. Waktu retensi relatif panjang.

3. Waktu retensi sangat tergantung pada jumlah dari cuplikan.

4. Kernungkinan penyerap.dapat berperan sebagai katalisator yang aktif.

Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik untuk senyawa

yang mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi. Meskipun demikian ada

keuntungan dari GSC bila dibandingkan dengan GLC. Fasa diam tidak dapat

diuapkan, karena tekanan uap dari padatan sangat rendah. Hingga dapat

menggunakan detektor-detektor yang sensitif, karena di sini tidak terjadi

"column bleeding".

Dalam tahun akhir-akhir ini GSC menjadi lebih penting yaitu setelah

diketemukannya penyerap-penyerap yang lebih baik. Contoh-contoh penyerap

adalah :


1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen

(dibandingkan dengan diamond) : ini digunaaan terhadap senyawa-senyawa

polar yang titik didihnya tinggi.

2) “molecular sieves" : ini merupakan zeolit buatan (= Na- atau CaAI-silikat),

dengan pori-pori yang sangat kecil/halus di dalamnya. Ukuran dari diameter

pori dinyatakan dalam A°. Sebagai contoh "Linde", mempuyai ukuran dari 3A°

hingga 13A°. Zeolit sangat stabil, pada suhu hingga 600°C. Molecular sieves

hanya menyerap molekul-molekul yang lebih kecil dari pori-porinya. Air sangat

cepat diserap hingga merupakan pengering yang sangat efisien. Molecular

sieves mempunyai sifat katalisator yaitu dapat merupakan zat dehidrator

(dehydrating agents). Sebagai contoh zeofit dapat mengubah alkohol menjadi

hidrokarbon/gasolin : R-OH → R-H. Sebelum digunakan biasanya molecular

sieves diaktifkan dengan memanaskannya selama 12 jam pada suhu 150°C

sambil dialiri gas H2 yang kering.

Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti hidrokarbon-hidrokarbon

menyerap sangat kuat. CO2 dan prosesnya tidak dapat balik sehingga zeolit

tidak digunakan bila CO2 dipakai sebagai gas pengangkut.

Perkembangan dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer-

polimer yang berpori seperti PORAPAK dan POLYPAK (nama

perdagangannya) juga CHROMOSORB.

Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :

1. Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2, R-OH dan

glikol-glikol, dan asam-asam lemak rendah.

2. Juga untuk seperti CO2,N2O,O2 juga yang lainnya.

d. Kromatografi gas-cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)

Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :

1. Kecepatan :

a. Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengadakan

kesetimbangan antara fasa bergerak dengan fasa diam.

b. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.Hingga waktu

pemisahan sangat cepat (diukur dalam menit).


2. Sederhana :

Alat GLC relatif sangat mudah dioperasikan. Interprestasi langsung

dari data yang diperoleh dapat dikerjakan. Harga dari alat GLC relatif

murah.

3. Sensitif :

GLC sangat sensitif. Alat yang paling sederhana dapat mendeteksi

konsentrasi dalam ukuran 0,01% (= 100 ppm). Alat-alat GLC yang

lebih rumit dapat mendeteksi senyawa yang Konsentrasirrya hanya

beberapa alat yang tertentu sekarang dapat dibuat dengan

kemampuan mendeteksi "parts per billion", hingga dalam jangkauan

pikogram = 10 g. Disebabkan sensitivitas yang tinggi dari GLC maka

hanya memerlukan sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya dalam

ukuran mikroliter.

4. Pemisahan : (resolution = performance).

Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan moleku-molekul dari

suatu campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan dengan

cara-cara yang lain.

Misalnya pemisahan metil ester-metil ester dari :

1. Asam stearat dengan ttd 232°C pada tekanan 15 mmHg CH3(CH,)t6

COOH.

2. Asam oleat dengan ttd 229°C pada tekanan 15 mm Hg CH3(CH,)7CH =

CH(CHZ)7COOH:

3. Asam linoleat dengan ttd 237°C pada tekanan I5 mm Hg CH j(CHZ)4 CH

= CH = CHCHZCH = CH (CH,)7COOH.

Senyawa-senyawa tersebut tak mungkin dipisahkan dengan cara distilasi

atau dengan ekstraksi, tetapi sangat mudah dipisahkan dengan GLC, yang

hanya membutuhkan waktu sekitar 23 menit.

5. Analisa dapat digunakan sebagai :

1. Analisa kualitatif yaitu dengan membandingkan waktu retensi.

2. Analisa kuantitatif yaitu dengan penghitungan luas puncak.

3. Alat GLC dapat dipakai dalam waktu yang lama dan berulang-ulang.

a. Prinsip Krimatografi Gas-Cair (GC)


Prinsip kerja kromatografi gas adalah sampel (cuplikan/analit) diinjeksikan ke

dalam kolom dan diuapkan lalu dielusi oleh aliran gas inert (sebagai fasa

gerak). Pada kromatografi gas, fasa gerak tidak berinteraksi dengan molekul-

molekul analit. Fungsi fasa gerak, hanya berfungsi sebagai transpor analit atau

cuplikan untuk bergerak di sepanjang kolom. Proses pemisahan terjadi karena

perbedaan interaksi analit dengan fasa diam.

Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah teruapkan

masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen dari

cuplikan. Kemudian komponen-komponen dideteksi oleh detektor, dan sinyal

dalam bentuk puncak akan dihasilkan oleh pencatat.

b. Bagian alat kromatografi gas

(FID/TCD)Detektor

GC

OvenGas

Gambar 1. Skema alat GC

Kolom

Injektor

Alat GLC atau GC terbentuk atas 7 bagian yang pokok seperti pada

gambar bagian-bagian alat berikut. Tujuh bagian pokok dari kromatografi

gas seperti pada gambar :

1. Silinder tempat gas pembawa/pengangkut

2. Pengatur aliran dan pengatur tekanan

3. Tempat injeksi cuplikan

4. Kolom

5. Detector

6. pencatat

7. Terminal untuk 3, 4 dan 5


Oven

kolom

Injektor

Pemasok

Gas

Detektor Rekorder

Gas kromatografi terdiri dari : Suatu aliran gas,

Suatu tempat injeksi,

Suatu kolom pemisah

Suatu detektor

Bagian-bagian dari kromatografi gas adalah :

(1) Gas pengangkut

Gas pengangkut (carrier gas) ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi.

Biasanya tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat

besar untuk digunakan secara Iansung.

Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :

a. Harus inert, tidak bereaksi dengart cuplikan, cuplikan-pelarut, dan

material dalam kolom.

b. Murni dan mudah diperoleh, serta murah.

c. Sesuai/cocok untuk detektor.

d. Harus mengurangi difusi gas.

Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon

dioksida dan hidrogen. Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah

terbakar, tetapi sangat mahal. H2 mudah terbakar, sehingga harus berhati--

hati dalam pemakaiannya. Kadang-kadang digunakan juga C02.

Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh ditektor yang

digunakan. Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan

keluaran dan pengukur tekanan. sebelum masuk ke kromatograf, (harusnya)

ada pengukur kecepatan aliran gas serta sistem penapis molekuler untuk

memisahkan air dan pengotor gas lainnya. Pada dasrnya kecepatan alir gas

diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat yaitu pengatur kasar (coarse)

pada tabung gas dan pengatur halus (fine) pada kromatograf. Tekanan gas

masuk ke kromatograf (yaitu tekanan dari tabung gas) diatur pada 10 s.d 50

psi (di atas tekanan ruangan) untuk memungkinkan aliran gas 25 s.d 150

mL/menit pada kolom terpaket dan 1 s.d 25 mL/menit untuk kolom kapiler.

http://murah.c.sesuai/cocok

http://murah.c.sesuai/cocok


(2). Pengatur aliran dan pengatur tekanan

Ini disebut pengatur atau pengurang Drager. Drager bekerja baik pada 2,5

atm, dan mengalirkan massa aliran dengan tetap. Tekanan lebih pada

tempat masuk dari kolom diperlukan untuk mengalirkan cuplikan masuk ke

dalam kolom. Ini disebabkan, kenyataan lubang akhir dari kolom biasanya

mempunyai tekanan atmosfir biasa. Juga oleh kenyataan bahwa suhu kolom

adalah tetap, yang diatur oleh thermostat, maka aliran gas tetap yang masuk

kolom akan tetap juga.

Demikian juga komponen-komponen akan dielusikan pada waktu yang tetap

yang disebut waktu penahanan (the retention time), tR. Karenakecepatan

gas tetap, maka komponen juga rncmpunyai volume karakteristik terhadap

gas pengangkut = volume penahanan (the retention volume), vr. Kecepatan

gas akan mempengaruhi effisiensi kolom.

Harga-harga yang umum untuk kecepatan gas untuk kolom yang memiliki

diameter luar.

1/4" O.D : kecepatan gas 75 ml/min

1/8" O.D : kecepatan gas 25 ml/min.

Kita akan meninjau bagaimana cara untuk mendapatkan harga kecepatan

aliran yang optimum untuk suatu pemisahan tertentu.

(3). Tempat injeksi (The injection port)

Dalam pemisahan dengan GLC cuplikan harus dalam bentuk fasa uap. Gas

dan uap dapat dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa

organik berbentuk cairan dan padatan. Hingga dengan demikian senyawa

HETP

HTEP min

Kecepatan aliran

ml/min

Kecepatan aliran optimum


yang berbentuk cairan dan padatan pertama-tama harus diuapkan. Ini mem-

butuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom. Panas itu terdapat pada

tempat injeksi seperti pada gambar 2. bagan injektor.

Tempat injeksi dari alat GLC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu

dari tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini

adalah batiwa suhu tempat injeksi sekitar 50°C lebih tinggi dari titik didih

campuran dari cuplikan yang mempunyai titik didih yang paling tinggi. Bila kita

tidak mengetahui titik didih komponen dari cuplikan maka kita harus mencoba-

coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi dinaikkan. Jika puncak-

puncak yang diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu percobaan pertama

terlalu rendah. Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi,

sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau peruraian dari

senyawa yang akan dianalisa.

Tempat injeksi (injektor):

Gas

pembawa

Glass insert

Septum

Split

Baut Septum

Kolom GC

Adaptor Kolom

Purge

Pengarah jarum

injektor

Gambar 2. Bagan injektor GC

Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui

tempat injeksi. Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang

sering disebut "a gas tight syringe".

Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu

banyak, karena GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan

pada waktu kita mengandakan analisa 0,5 -50 ml gas dan 0,2 - 20 ml untuk

cairan seperti pada gambar 3.


Tempat injeksi (injektor):

Gas

pembawa

Glass insert

Septum

Split

Baut Septum

Kolom GC

Adaptor Kolom

Purge

Pengarah jarum

injektor

Syringe(10 L)

3. Bagan injektor GC

Untuk

Cairan

Untuk

gas

(4). Kolom

Kolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Bentuk dari kolom dapat

lurus, bengkok, misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral. Biasanya

bentuk dari kolom adalah kumparan. Kolom selalu merupakan bentuk tabung.

Tabung ini dapat terbuat dari :

tembaga (murah dan mudah diperoleh)

plastik (teflon), dipakai pada suhu yang tidak terlalu tinggi.

baja (stainless steel), (mahal)

alumunium

gelas

Perhatian : meskipun tembaga agak murah, tetapi tidak selalu dapat

digunakan karena kadang-kadang dapat menimbulkan serapan yang tidak

diinginkan atau dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa organik seperti

amina, asetilena, terpen dan stereoid.

Panjang kolom dapat dari 1 m sampai 3 m. Diameter kolom rnempunyai

berbagai ukuran, biasanya pengukuran berdasarkan diameter dalam dari

kolom gelas yaitu antara 0,3 mm hingga 5 min. kebanyakan kolorn yang

digunakan berupa staninles steel dengan diameter luar (OD) dari I/S atau 1/4

inch (0,3 atau 0,6 cm). Pada GSC kolom diisi dengan penyerap (adsorbent),

sedangkan pada GLC kolom diisi dengan "solid support" (padatan pendukung)

yang diikat oleh fasa diam.


JENS KOLOM (FASA DIAM)

KOLOM KEMAS (PACKED) KOLOM KAPILER (CAPPILARY)

ADSORBEN(FS DIAM)

LAPISANFASA DIAM

1 – 5 m 15 – 30 m

Gambar 4. Kolom GC

Pada GC, dikenal dua tipe kolom, yaitu kolom kemas (Packed) dan kolom

kapiler (tabung terbuka/cappilary).

1. Kolom Kemas (Packed)

Kolom kemas terbuat dari bahan gelas atau logam dengan ukuran diameter

dalam (ID, Internal Diameter) 1 s.d 8 mm, dan panjang antara 2 s.d 20 m.

Kolom kemas yang sering dijumpai memiliki nilai perbandingan volume fase

diam per volume fase gerak, VS/VM antara 15 s.d 20 dan terdiri dari 100 s.d

1000 plat teoritis per kaki (foot). Cukup banyak kolom terpaket yang memiliki

jumlah plat teoritis yang lebih tinggi. kolom terpaket yang baik memiliki jumlah

plat teoritis sampai 20.000 plat per kaki (1 foot = 12 inchi = 30,48 cm).

KOLOM KEMAS (PACKED)

Biasanya 1/8” diameter (3,2 mm O.D, 22 mm I.D),

Panjang 1 – 2 m

Kecepatan alir maksimum 1 mL/menit atau 8 cm/menit

2. Kolom Kapiler

Kolom kapiler dibagi menjadi 2 tipe dasar yaitu :

a. “Wall Coated Open Tubular – WCOT” : kolom kapiler yang dilapiskan

dengan lapisan tipis fasa diam. Bahan kolom adalah baja nirkarat,

aluminium, tembaga, plastik dan gelas. Kolom WCOT produk tahun


1990 an dibuat dari leburan silika yang disebut juga kolom FSOT – Fused

Silica Open Tubular Column) yang diperkuat dengan lapisan poli-amida di

bagian luarnya, bersifat sangat pleksibel sehingga dapat digulung

dengan diameter beberapa inchi. Kapasitas sampel sangat rendah

(<0,01µL).

b. “Support Coated Open Tubular – SCOT” : Permukaan dalam kapiler

dilapiskan dengan lapisan tipis (~30 µm) fasa pendukung, seperti tanah

diatome, grfit, oksida metal atau silikat. Tipe ini mampu menahan fasa

diam beberapa kali lebih banyak dari tipe WCOT sehingga kapasitas

sampelnya lebih besar. Secara umum efisiensi kolom SCOT lebih kecil

dari kolom WCOT tetapi lebih besar dari kolom terpaket.

KOLOM KAPILER

Fasa Diam

Cair

Penyangga padat dila

pisi fasa diam cair

Partikel fasa diam

padat

Dinding kolom

Wall-coated

open tubular

column

(WCOT)

Support-coated

open tubular

column

(SCOT)

Porous-layer

open tubular

column

(PLOT)

Gambar 5. Jenis kolom kapiler

Kolom kapiler memiliki diameter dalam antara 0,3 – 0,5 mm, di bagian

dalam kolom dilapiskan dengan fasa diam cairan yang sangat tipi (~ 1

µm). Penurunan tekanan di dalam kolom kapiler bisa diabaikan,

sehingga bisa dibuat sangat panjang (lebih dari 100 m). Perbandingan

volume fasa diam VS.volume fasa gerak, VS/ Vm diantara 100-300,

sehingga sangat efisien. kolom kapiler dengan ratusan ribu jumlah pelat

teori juga sudah dibuat. kolom terbuat dari baja nirkarat, gelas, leburan

silika, atau teflon. Supaya bisa dimasukkan ke dalam oven, kolom

digulung dengan diameter gulungan antara 10 – 30 cm.

I s i k o l o m

(a). Padatan pendukung.


Padatan pendukung berfungsi mengikat fasa diam. Kebanyakan zat ini

berupa tanah diatorne yang telah dipanaskan/dikeringkan. Pendukung ini

disebut "diatomite". Diatomite terdiri dari satuan ganggang bersel satu yang

disebut diatom yang pori-porinya sangat kecil. Luas permukaan dari struktur

berpori sekitar 20 m2/g. Luas permukaan yang besar ini d ibutuhkan untuk

mendistribusikanfasa diam yang bersifat cairan dalam GC.

Persyaratan dari padatan pendukung yang baik :

1. Inert (tidak menyerap cuplikan).

2. Kuat, stabil pada suhu-suhu yang tinggi.

3. Memiliki luas permukaan yang besar : 1 - 20 m2/g.

4. Perrnukaan yang teratur, ukuran yang sama; ukuran pori sekitar l ON

5. Harus mernpunyai tahanan yang rendah terhadap gas pengangkut.

Padatan pendukung yang biasa digunakan adalah kiesel guhr

(forementionned - diatomaceous earth). Nama dalam perdagangan :

Aluminium

Diatoport

Chromosorb.

Padatan pendukung ini terutama terdiri dari Si02 :

91 %

5 %

2 %

0,5 %

-

-

-

-

Si02

Al203

Fe203

CaO, dan oksida-oksida lainnya

Ada beberapa jenis chromosorb :

a. Chromosorb G : luas permukaan yang kecil (0,5 m 2/g), hanya dapat

digunakan untuk mengikat faSa cair dalam jumlah yang sedikit (± So1o),

merupakan materi yang sangat keras; baik untuk pemisahan senyawa-

OH OH OH l l l struktur : ─ Si ─ O ─ Si ─ O ─ Si ─ polimer silicon-oksigen


senyawa yang polar. Ini merupakan padatan pendukung hingga yang

bersifat universal.

b. Chromosorb P : berwarna kemerah-merahan (P = pink), biasanya

digunakan untuk senyawa-senyawa yang apolar, terutama hidrokarbon.

c. Chromosorb W : berwarna putih, agak mudaan digunakan untuk

senyawa-senyawa polar.

Chromosorb-chromosorb yang kotor dapat bereaksi dengan cuplikan; hal ini

akan menyebabkan puncak berekor. Interaksi utama antara padatan

pendukung dengan molekul-molekul cuplikan adalah ikatan hidrogen melalui

gugus-gugus OH dari chromosorb. Untuk mencegah hal ini, chromosorb

harus direaksikan terlebih dahulu hingga ia menjadi kurang aktif.

Pengaruh permukaan penyangga

a. Gusus hidroksil tunggal

- HCl CH3

- Si – OH + (CH3)2 Si Cl2 - Si – O – Si – Cl

Dimetildiklorosilan CH3

(DMCS)

CH3 - HCl CH3

- Si – O - Si - Cl + CH3OH - Si – O – Si – O – CH3

CH3 CH3

b. Gugus hidroksil berdampingan

CH3 CH3

Si

OH OH O O

- Si - O – Si - + (CH3)2 Si Cl2 - Si - O - Si - + 2 HCl

Ukuran dari padatan pendukung yang digunakan adalah :

Untuk kolom I/8 inch : 100/120 atau 80/I00 mesh

Untuk kolom 1/4 inch : 60/80 atau 40/60 mesh

100/ 120 mesh - 0,15 - 0,13 mm; 80/ 100 mesh ti 0,18 - 0,15 mm

60/80 mesh ti 0,25 - 0,18 mm; 40/60 mesh - 0,40 - 0,25 mm.

(b). F a s a d i a m


Dalam GC fasa diam berupa cairan. Pada fasa cairan inilah

pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi. Dasar kerja

adalah Partisi antara fasa cairan dan fasa bergerak ( = gas). Seperti

telah dibicarakan di muka bahwa proses GC adalah mirip dengan

proses ekstraksi. Dalam GC fasa diam disebut juga fasa cair atau

mudahnya pelarut/solvent.

Persyaratan untuk fasa cair yang baik adalah sebagai berikut :

1. Cuplikan-cuplikan harus menunjukkan koefisien distribusi yang

berbeda.

2. Cuplikan-cuplikan harus mempunyai kelarutan yang tertentu

dalam pelarut (= fasa cair).

3. Fasa cair harus mempunyai tekanan uap yang sangat rendah

pada suhu-suhu yang tinggi : 0,01 - 0., 1 mm Hg.

4. Secara kimia ia harus stabil dan inert.

5. Harus mempunyai kekentalan yang rendah, sehingga tidak

mengikat gas.

6. Harus dengan baik tersebar dan mengikat pada padatan pen-

dukung.

7. Harus larut dengan baik pada pelarut organik yang mempunyai

titik didih rendah. Ini penting dalam pembuatan kolom.

Meskipun banyak pcrsyaratan, namun dcmikian cukup banyak

pelarut-pelarut organik yang dapat digunakan. Kenyataan, ketepatan

dan sefektivitas dari GLC/GC tergantung pada pemilihan dari pelarut-

pelarut yang tersedia. Biasanya persentase dari fasa cair pada

padatan pencfukunL adalah I0% dari berat.

1). Senyawa (dari cuplikan) terpisah berdasarkan atas kelarut an

mereka (= afinitas) dalam fasa cair.

2). Padatan pendukung harus memiliki luas permukaan yang besar

untuk mengikat fasa cair.

Sehingga padatan pendukung mengikat fasa cair yang ditempatkan dalam

kolom. Bila hal ini tidak terjadi maka fasa cair akan terlepas oleh tekanan gas.


(5) Detector

Puluhan jenis detektor sudah dikembangkaan dan digunakan untuk GC.

Karakteristik detektor ideal untuk GC adalah :

1. Cukup sensitif

2. Sifat ksetabilan dan sifat pengulangan (reproducibilility) yang baik

3. Tanggap linier terhadap kuantitas analit.

4. Rentang temperatur dari temperatur ruang s.d 400°C.

5. Waktu tanggap yang pendek.

6. Kehandalan yang tinggi.

7. Mudah digunakan.

8. Tidak merusak sampel.

Detektor yang paling banyak digunakan adalah :

a. Detektor ionisasi Nyala (FID, Flame Ionization Detektor)

Prinsip kerja FID adalah sebagai berikut :

1. Effluen dari kolom dicampur dengan gas hidrogen dan udara, kemudian

dinyalakan dengan api listrik.

2. Komponen organik dari sampel yang masuk ke nyala akan mengalami

pirolisis, menghasilkan ion-ion dan elektron yang akan memberikan sifat

hantaran listrik pada nyala.

3. Ratusan volt tegangan listrik dc dipasangkan diantara ujung pembakar

dengan elektroda kolektor yang ditempatkan di atas nyala.

4. Arus listrik yang dihasilkan (dalam pA ~ 1012 Ampere) dimasukkan ke

sebuah penguat operasional berimpedansi tinggi.

F I DFlame Ionization Detector (Detektor Pengionan Nyala)

Probe sinyal

Probe penyulut

Ujung nyala

Silinder pengumpull

Penutup tower

Gas pembawa

Gas H2 + udara

(300-400 mL/menit)

Gambar 8. Bagan FID

-

+


b. Detektor konduktivitas Thermal (TCD, Thermal Conductivity Detector)

TCD disebut juga Katharometer. TCD adalah detektor yang bekerjanya

berdasarkan perubahan sifat hantaran panas eluen dalam keadaan murni

dan dalam keadaan tercampur spesi lain seperti analit. Elemen pengindera

TCD adalah kawat halus yang dibuat dari Pt, Au, W atau termistor semi

konduktor yang dipanaskan secara listrik. Perubahan sifat hantaran panas

gas akan menyebabkan perubahan efektivitas pemindahan energi panas

dari kawat halus ke gas sehingga temperatur kawat halus menjadi berubah.

Perubahan temperatur kawat halus akan mengubah nilai resistansi kawat

halus.

T C DThermal Conductivity Detector (Daya hantar panas)

Aliran gas

Aliran gas

Sambungan ke sumber

Tenaga listrik dan rangkaian

Filamen

Gambar 7a. Bagan TCD

c. Detektor Penangkap Elektron (ECD, Electron Capture Detector)

ECD bekerja seperti penghitung proporsional pada pengukuran

radiasi sinar-x. Eluen dari kolom dilewatkan melalui pemancar sinar-β

(seperti nikel-63 atau tritium yang diabsorb ke permukaan platina atau

titanium). ECD memiliki respons selektif dan sangat peka terhadap

gugus fungsional yang bersifat elektronegatif seperti halogen,

peroksida, kuinon, dan gugus nitro. ECD tidak sensitif terhadap gugus

amina, alkohol dan hidrokarbon. ECD digunakan untuk analisis

insektisida yang mengandung klor dan ECD tidak merusak sampel.

Keuntungan ECD :

Mempunyai limit deteksi cukup rendah = 10-15 g/s untuk berbagai

senyawa terhalogenasi (PCB, DDT dll.)


Rentang dinamiknya 104

Kelemahan ECD :

Menggunakan sumber radioaktif Ni-63

Mudah terkontaminasi oleh O2, H2O, overload sampel

Perlu pemeliaharaan tinggi

Mempunyai variabilitas tinggi respon terhadap zat terhalogenasi

.

Dapat menyebabkan sakit kepala bila digunakan untuk

mendeteksi CH2Cl2 dengan adanya CCl4.

E C DFlame Ionization Detector (Detektor Pengionan Neale)

+

-

Gambar 9. Bagan ECD

Sumber

Radioaktif Ni-63

Gas pembawa

Arah keluar

d. Detektor Thermionik (TID, Thermionic Detector)

TID bersifat selektif untuk senyawa organik yang mengandung fosfor

dan nitrogen. respon terhadap P, 10 kali respon terhadap N, 10.000

s.d 1.000.000 kali respons terhadap atom C, dan 500 kali respons P

oleh FID. TID digunakan untuk pestisida yang mengandung P.

e. Detektor Emisi Atomik, (AED, Atomic Emission Detector)

AED adalah detektor GC mutakhir yang ada di pasar komersial.

Detektor ini bekerja berdasarkan emisi atomik. Eluen dimasukkan ke

dalam plasma He yang mendapatkan energinya dari gelombang mikro

yang digabungkan dengan sebuah spektrometer emisi optik “diode

array”.

(6) Rekorder atau Sistem Data


Sinyal analitik yang dihasilkan detektor dikuatkan oleh rangkaian elektronik

agar bisa diolah oleh rekorder atau sistem data. Sebuah rekorder bekerja

dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan tertentu. di atas kertas

tersebut dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal keluaran detektor

sehingga posisinya akan berubah-ubah sesuai dengan dinamika keluaran

penguat sinyal detektor. Hasil rekorder adalah sebuah kromatogram

berbentuk pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi sampel dan jenis

detektor yang digunakan.

Rekorder biasanya dihubungkan dengan sebuah elektrometer yang

dihubungkan dengan sirkuit pengintregrasi yang bekerja dengan menghitung

jumlah muatan atau jumlah energi listrik yang dihasilkan oleh detektor.

Elektrometer akan melengkapi pik-pik kromatogram dengan data luas pik

atau tinggi pik lengkap dengan biasnya.

Sistem data merupakan pengembangan lebih lanjut dari rekorder dan

elektrometer dengan melanjutkan sinyal dari rekorder dan elektrometer ke

sebuah unit pengolah pusat (CPU, Central Procesing Unit).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode kromatografi yang

mampu memisahkan campuran makromolekul, senyawa ionik, produk alam yang labil,

senyawa polimerik dan kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi dengan

cara penyarian berfraksi, penyerapan atau penukaran ion.

Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi kolom karena fasa

diamnya diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan bila ditinjau dari proses

pemisahannya KCKT digolongkan dalam kromatografi adsorpsi atau kromatografi

partisi. KCKT/HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini

menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang

sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi spesifik anatara

molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak.

KTKC juga merupakan teknik kromatofrafi yang paling banyak digunakan, dengan

keunggulan-keunggulan:


1. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif,

2. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap dan spesi yang mudah

rusak oleh panas,

3. Bisa dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik seperti

untuk analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat, hidrokarbon,

karbohidrat, obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik, steroid, spesi metal

organik, dan berbagai senyawaan norganik.

KCKT menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau padatan,

dan bisa dilbagi menjadi menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa

cairan atau padatan, dan bisa dilbagi menjadi 4 (empat) tipe utama yaitu:

1. Kromatografi Partisi (Luntuk solut senyawa polar tetapi bukan ionik berukuran

kecil)

2. Kromatografi Adsorpsi atau Kromatografi Padar-cairan (untuk pemisahan spesi

non-polar, isomer struktur,dan klasifikasi senyawa seperti pemisahan hidrokarbon

alifatik dari alkohol alifatik)

3. Kromatografi Ion (untuk spesi ionik ber-Mr rendah)

4. Kromatografi Eklusi-ukuran atau Kromatofrafi Gel (untuk solut dengan Mr > 1000)

yang bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi gel.

Teknik pemisahan dalam KCKT berdasarkan fasa diam dan fasa geraknya :

1. Kromatografi Partisi

Komponen sampel (linarut) dibagi antara fasa gerak cair dengan cairan yang tidak

bercampur yang dilapiskan pada suatu partikel padat sebagai fasa diam. Fasa diam

dapat berupa cairan yang disalutkan pada partikel penyangga. Komponen sampel

yang terikat lebih banyak di fasa diam akan tertahan lama dalam kolom. Bila fasa

diam lebih polar daripada fasa gerak maka disebut fasa normal (Normal phase). Dan

bila fasa gerak lebih polar daripada fasa diam maka disebut fasa terbalik (Reverse

phase).

2. Kromatografi Adsorpsi

Fasa diam yang digunakan pada umumnya adalah bahan alam polar seperti partikel

silika atau alumina hidrat. Fasa gerak dan komponen sampel (linarut) berkompetisi


terhadap lokasi aktif adsorpsi pada partikel fasa diam. Komponen yang terikat lebih

kuat akan bertahan lebih lama dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada

kepolaran sampel. Retensi ini dapat diatur dengan mengatur kepolaran fasa gerak

(eluen).

3. Kromatografi Penukar Ion

Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fasa gerak dan fasa diam pada lokasi

penukaran. Lokasi ion ini biasanya dimobilisasi pada butiran kecil suatu resin yang

dibentuk melalui polimer silang. Kation diipisahkan dalam resin penukar kation yang

mengandung gugus fungsi yang bermuatan negatif seperti -SO3- dan –COO-,

sedangkan anion dipisahkan dalam resin penukar anion yang bermuatan positif

seperti –CH2N+(CH3)3, suatu ion amonium kuartener. Pemisahan terjadi akibat

partisi ion dalam derajat yang berbeda-beda.

a. Pelaksanaan HPLC

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi

kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung

melalui tekanan tinggi sampai dengan 400m. Ini membuatnya lebih ceHPLC

memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material

terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih

besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini

memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam

campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom

mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode

ini sangat otomatis dan sangat peka.

b. Beberapa efek utama pada KCKT

Efek Ukuran Partikel Paket. Koefisien trasfer massa, CM merupakan fungsi dari

kuadrat diameter partikel yang membentuk paket. Karena itu, efisiensi kolom

meningkat sangat nyata jika ukutan pertikel diperkecil.

Pelebaran zona Ekstra Kolom. Pada kromatografi cair, pelebaran zona yang

signifikan sering terjadi diluar paket kolom. Pelebaran zona ini disebut pelebaran

zona ekstra kolom, dan terjadi ketika fasa gerak membawa sampel pada daerah yang


tidak ada fasa diam seperti pada sistem injeksi, daerah detektor, dan sistem

sambungan perpipaan. Akibatnya bagian tengan pita solute bergerak lebih cepat dari

daerah pinggiran. Padakromatografi gas, pelebaranzona ekstra kolom menjadi

kurang significan karena tertutupi oleh pelebaran zona karena difusi. Pada

kromatografi cairan, pelebaran zona kerena difusi relatilf lebih lambat sehingga bisa

diabaikan.

Efek Jumlah Sampel pada tinggi Plat. HETP (dalam mm) akan naik jika ug sample/g

paking meningkat. Peningkatan semakin nyata jika faktor kapasitas solut meningkat.

Peningkatan HETP pada kromatografi partisi relatif lebih besar dari kromatografi fasa

terbalik. Perhatikan bahwa peningkatan HETP berarti penurunan jumlah plat atau

plenurunan efisiensi kolom.

c. Instrumentasi HPLC/KCKT

Instrumentasi KCKT, secara umum, dapat disimak pada skema/diagram alir

KCKT/HPLC. Perhatikan bahwa instrumentasi itu terdiri dari :

Penampung Fasa Gerak dan Sistem Penangan Solven,

Setem Pemompaan,

Sistem Injeksi Sample,

Kolom,

Detektor

Bahan dasar peralatan kromatografi umumnya terbuat dari bahan stainless steel

yang tahan terhadap korosi asam, basa dan pelarut organik. Bahan lain yang sering

digunakan adalah polytetrafluoroethylene (PTFE), gelas dan beberapa jenis plastik.

Skema/diagram alir HPLC :

a. Skema peralatan HPLC


b. Diagram alir HPLC

d. Penampung fasa Gerak dan Sistem Penanganan Solven

Penampung fasa gerak terbuat dari gelas atau baja nirkarat dengan volume 500ml

atau lebih. Penampung fasa gerak dilengkapi dengan alat pembuang gas (terutama

udara) terlarut. Sistem pembuangan gas bisa menggunakan teknik vakum, distilasi,

pemanasan dan plengadukan,l atau pengusiran gas terlarut menggunakan aliran


gas lain ylang memiliki kelarutan sangat rendah. Silstem ini juga dilengkapi dengan

sistem filter untuk menyaring debu dan partikulat lain dari dalam solven. Teknik

praktis untuk membuang ga dan partikulat adalah dengan cara menyarilng solven

melalluail sarinagn milipore dan tekni vakum.

Pemisahan yang dilakukan dengan satu jenis solven dengan campuran yang tetap

disebut elusi isokratik. Seringkali efisiensi pemisahan bisa ditingkatkan dengan

penggunaan 2 atau lebih solven dengan plerbedaan sifat kepolaran yuang signifikan

secara bertahap. Teknik ini desebut elusi gradien. Percampuran dua solven atau

lebih pada teknik gradien bisa dilakukan dengan perubahan linier atau secara

eksponensial terhadap waktu.

e. Sistem Pemompaan

Pompa berfungsi untuk mendorong fasa gerak dan sampel masuk ke dalam kolom.

Tekanan pompa yang diperlukan untuk memompa fasa gerak harus cukup tinggi

karena ukuran fasa diam di dalam kolom sangat kecil.

Syarat pompa :

Dapat memompakan fasa gerak secara konstan

Dapat memberikan tekanan cukup tinggi

Memberikan fluktiasi tekanan seminimal mungkin

Memberikan noise yang rendah

Cara kerja sederhana

Cukup inert terhadap pelarut-pelarut yang digunakan

Sistem pemompaan solven pada KCKT memerlukan syarat-syarat sebagai

berikut :

Tekanan harus bisa mencapai 6000 psi

Keluaran harus bebas pulsa

Keceplatan alir antara 0,1 s.d. 10ml per menit

Pengulangan pengaturan kecepatan alliran tidak berbeda lebih dari0,5%

Terbuat dari bahan tahan korosi


Ada tiga tipe pompa KCKT; pompa balas (reciprocating pumps), pompa pemindah

(displacement pumps), dan pompa pneumatic pumps).

1. Pompa balas (reciprocating pumps) adalah pompa KCKT yang paling banyak

digunkan. Pompa lini memiliki ruangan kecil erisi soven yang dipompakan

dengan gerakan maju-mundur sebuah piston yang digerakkan oleh motor listrik.

Aliran diatur oleh dua buah katup bola yang bergantian membuka dan menutup.

Piston bisa kontak langsung dengan solben atau melaluli sebuah diafragma yang

menerukan tekanan piston ke solven.

Kelemahan pompa balas ini adalah aliran yang dihasikan masih berpulsa,

sehingga harus diredam menggunakan teknik pengoperasian dua buah pompa

secara paralel (tetapi berbeda fasa, maksudnya ketika pompa yang satu

memompa pompa yang lain berpindah ke posisi siap memompa) dengan

pengaturan kecepatan tertentu.

Keunggulan teknik ini adalah volume internal pompa yang relatif rendah (35 –

400 uL), tekanan kelua yang tinggi (sampai 10.000 psi), mudah diadaptasi untuk

elusi gradien, dan kecepatan aliran yang tetap (tidak dipengaruhi oleh tekanan

balik dan kekentalan solven).

2. Pompa pemindah (displacement Pumpls) biasanya terdiri dari sebuah ruanan

berukuran relatif besar dengan bentuk seperti syringe dan berisi solven. Sebuah

selinder plencelup (plunger) yang diaktifkan oleh mekanime pemutar skrup yang

digerakkan oleh motor langkah (Lstepper motor), dimasukkan ke dalam ruang

solven. Akibatnya akan ada bagian solven yang didorong (dipompa) keluar.

Pompa ini juga menghasilkan aliran llyang tidak dipengaruhi oleh viskosits dan

tekanan balik, namun keluarnya bebas pulsa.

Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas solven (~250 mL) yang

ditentukan oleh ukuran selinder plencellupl dan penggantian solven yang relatif

sulit ( karena solven lama harus dikosongkan dan dibersihkan dari dalam

poompa dan solven baru dilmasukkan ke dalam pompa.


3. Pompa pneuematik (pneumatic pump) palling sederhana, fasa gerak

dimasukkan ke dalam wadah elastik dan dimasukkan lagi ke dalam wadah

yang bisa ditekan menggunakan gas. Tekanan gas akan menekan wadah

elastik dan sehingga solven yang ada didalamnya akan dipompa keluar. Pompa

jenis ini menghasilakann aliran bebas pulsa dan berharga murah.

Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas dan tekanan keluaran dan

ketergantungan plada viskositas dan tekanan balik yang dihasilkan kolom.

Umumnya sistem pompa pada KCKT dilengkapi dengan pengaturan aliran dan

sistem pemrograman terkomputerisasi. Beberapa instrumen memiliki fungsi

pencampuran solven secara berkesinambungan atau secara bertingkat sehingga bisa

memvariasikan. Pada gambar ini pencampuran eluen dilakukan oleh katup pengatur.

Pada sistem yang lain tiap solven dialirkan menggunakan satu sistem pompa. Sistem

elusi seperti ini disebut dengan sistem gradien.

f. Injeksi sampel

Sampel yang diinjeksikan ke kolom KCKT hanya dianta 0,x – 500 uL, dsan harus

diinjeksikan tanpa menurunkan tekanan kolom. Kondisi ini menyulitkan penginjeksian

dalam jumlah tetap, jika dilakukan secara manual. Cara menginjeksikan sampel yang

paling banyak digunakan adalah menggunakan sistem simpul (sampling loops).

Perhatikan bahwa sampel diinjeksikan pada tekanan normal dalam jumlah

berlebih. Sebagian sampel akan keluar melalui ‘vent’ dan sebagian lagi tersisa di

awal simpul.

Ketika simpul disambungkan ke sistem aliran fasa gerak, tekanan sampel

langsung berubah dan jumlah sampel yang masuk ke dalam sistem adalah

volume simpul ylang tersambung ke sistem aliran.

Sistem simpul yang umum dijumpai memungkilnkan injeksi dalam jumlah 5 – 500

uL, tekanan mencapai 700 psi, dengan kesalahan relatif dalam permil. Sistem

simpul injeksi sampel mikro memungkilnkan injeksi samplel sebanyak 0,5 – 5 uL.

Ingat bahwa pernyataan ini berdasarkan buku ajar tahun 1992. Dalam 10 tahun

terakhir peningkatan teknologi sudah memungkilnkan sintem ilnjeksi yang jauh


lebih baik.

g. Kolom dan pelarut

Kolom KCKT umumnya dibuat dari pipa baja nirkarat namun ada juga yg terbuat

dari pipa kaca berdinding tebal. Kolom kaca memiliki kemampuan tekanan

maksimum 600 psi. Panjang kolom umumnya antara 10 – 30 cm dan berbentuk

lurus. Jika diperlukan kolom yang lebih panjang, beberapa kolom bisa disambung

secara serial. Diameter dalam kolom umumnlya antara 4 – 10 mm, dengan ukuran

partikel 3,5 dan 10 um. Kolom KCKT yang paling banyak digunakan adalah panjang

25 cm, diameter 4,6 mm, dengan ukuran partikel 5 um. Kolom ini memiliki 40.000

s.d. 60.000 plat per meter.

Sudah diproduksi kolom kinerja tinggi dan kecepatan tinggi dengan ukuran lebih

kecil. Kolom jenis ini bisa memiliki samplai 100.000 plat per meter dan

menggunakan eluen dalam jumlah jauh lebih sedikit. Sebellum kolom analitik, sering

dipasangkan kolom penjaga (quard colomn) berukuran kecil yang berflungsil

sebagai pemisah partikulat dan kontaminan dari solven. Kolom lpenjaga juga

berflungsi sebagai penjenuh fasa gerak dengan fasa diam. K omposisi fasa diam di

dalam kolom penjaga harus sama dengan komposisi fasa diam di dalam kolom

analitik.

Partikel berpori dengan diameter sangat homogen ( ukuran plartikel di antara 3 –

10 um). Partikel berpori ini kerapkali dilapiskan dengan lapisan tipis senyawan

organik yang terikat (secara fisik atau kimik) ke permukaan butiran.

Ada dua perbedaan fase dalam KCKT, yang mana tergantung pada polaritas relatif

dari pelarut dan fase diam.

1. Fase normal KCKT. Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda

baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut

sebagai fase normal, hal ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari KCKT.

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar

misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm


(dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom diperlukan. Namun

kromatogram yang berkualitas lebih baik seringkali memerlukan pengaturan

templertur. Karena itu ada KCKT yang dilengkapi dengan oven thermostat dengan

templeratur yang bisa mencapi 1500C. Pemanasan di bawah temperatur didih air

bisa dilakkukan dengan mengglulnakan mantel air yuang dialirkan dari plamanas

thermostat.

Pengepakan kolom KCKT dapat dibagi menjadi dua tipe yaitu pellicular dan

partikel berpori.

Tipe Pellicular berupa resin penukar ion, silika atau alumina yang diendapkan

membentuk lapisan berpori di atas butiran-butiran polimer atau gelas yang tidak

berpori yang berbentuk sferis. Fase diam berikutnya (cairan) bisa diikatkan pada

lapisan pertama.

Tipe partikel berplori terdiri dari silika, alumina atau resin berbentuk akan melekat

lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh

karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

2. Fase balik KCKT. Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi

menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada

permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai

contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan

molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak

akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika

(fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-

molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak

bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan

cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya

dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut

dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana


halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau

metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan

waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa

molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase

balikKCKT adalah bentuk yang biasa digunakan dalam KCKT.

h. Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor

disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana

sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum

dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang

berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan

bergantung pada :

Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada

ukuran partikel)

Komposisi yang tepat dari pelarut

Temperatur pada kolom

i. Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.

Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan

ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa

panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar

melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan

mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.


Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang

melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang

digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnyaTetapi berbeda,

senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda

dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah

205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran

metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang

lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Berbeda dengan GC, KCKT tidak memiliki detektor yang bersifat umum dengan

kehandalan tinggi seperti FID dan TCD. Karakteristik detektor ideal untuk KCKT sama

dengan karakteristik untuk detektor ideal GC, kecuali rentang temperatur tidak perlu

terlalu lebar, tetaplli detektor KCKT harus memiliki volume internal yang rendah (untuk

mengurangi pelebaran zona).

Detektor KCKT dapat dikelompokkan ke dalam dua tipe yaitu:

1. Detektor yang berdasarkan sifat curah fasa gerak seperti fasa gerak, indeks refraksi,

konstanta dielektrik dan kerapatan,

2. Detektor yang berdasarkan sifat solute seperti serapan ultraviolet, pendaran, atau

arus diffusi, yang tidak dimiliki oleh fasa gerak.

j. Jenis-jenis Detektor pada KCKT

1. Detektor serapan

Detektor serapan yang banyak digunakan adalah sel dilalui aliran (flow through)

berbentuk Z untuk mengukur serapan eluen yang keluar dari kolom.Untuk menekan

pelebaran zona, volume sel dibatasi hanya antara 1 – 10 uL dengan panjang jalur

serapan 2 s.d 10 mm. Sel seperti memiliki batas tahan tekanan sebesar 600 psi.

Cukup banyak yang berkas ganda, baik yang dilengkapi dengan pencacah

(chopper) atau dengan filter. Instrumen berkas tunggal biasanya memiliki sistem

pengingat terkomputerisasi.

Detektor serapan paling sederhana adalah detektor serapan UV dengan filter.

Sumber UV berasal dari sebuah lampu Hg dengan intensitas sinar terbanyak pada

254 nm yang diisolasi menggunakan filter. Garis spektra pada 250, 313, 334 dan


365 nm, juga sering digunakan dengan cara mengganti filter.

Kebanyakan KCKT menggunakan detektor serapan UV yang dilengkapi

moonokromator dengan kemampuan pemindaian (scanning). Bahkan banyak yang

dilengkapi dengan cahaya tampak. Deketror jenis ini bisa diatur dengan beberapa

model seperti keseluruhan kromatografi dibuat berdasarkan panjang gelombang

tertentu, atau tiap kemunculan suatu pik panjang gelombang yang digunkan

disesuaikan dengan sifat pik bersangkutan. Lamdha yang sesuai dapat dicari

dengan cara pemindaian pik bersangkutan pada suatu analisis pendahuluan. Untuk

keperluan ini peralatan bisa diprogram melalui perangkat lunak komputer.

Detektor sinar yang paling kuat untuk KCKT adalah diode array yaitu sekumpulan

(bisa mencapai 1024 buah) fotodiode yang disusun membentuk barisan yang

menangkap spektrum sekaligus untuk semua panjang gelombang.

Detektor serapan infra merah juga banyak yang dibuat secara komersial. Teknik

yang diterapkan, mulai dari penggunaan filter, sampai ke sistem transformasi

fourier.

2. Detektor pendar

Pada deketor pendar, sinar pendaran diukur menggunakan detektor fotoelektrik

yang ditempakan pada posisi 900 terhadap sinar pengeksitasi. Detektor pendar

paling sederhana menggunakan sumber sinar pengeksitasi dari lampu Hg yang

dilengkpi filter. Instrumen yang lebih baik menggunakan sumber lampu xeon dan

monokromator kisi difraksi. Detektor pendar modern menggunkan sinar pengeksitasi

dari sumber laser yang bisa diatur.

3. Detektor indeks refraksi

Detektor indek refraksi dapat digunakan hampir untuk semua solute, sehingga

menjadi detektor universal seperti halnya FID pada GC. Detekor ini tidak

dipengaruhi oleh kecepatan alir sehingga hasil ukuran dapat dipercaya. Sayangnya

detektor ini tidak sensitif seperti detektor lainnya, tetapi peka terhadap perubahan

temperatur sehingga harus distabilkan pada tingkat ketelitian sampai beberapa

perseribu (0,00x) 0C.


4. Detektor

Pada detektor ini, efluen dari kolom dimasukkan ke dalam nebuliser dan diubah

menjadi kabut halus oleh aliran gas nitrogen atau uadara. Kabut halus dialirkan ke

tabung yang bertemperatur terkontrol untuk menguapkan fasa gerak sehingga

dihasilkan uap analit. Partikel uap analit kemudian dialirkan melalui jalur sinar laser.

Radiasi hamburan diukur plada sudut tegak lurus menggunakan fotodiode. Detektor

ini baru dikembangkan dan diharapkan bisa menjadi detektor umum untuk KCKT

(seperti FID pada DC).

5. Detektor elektrokimia

Kelompok detekor ini berdasarkan empat metode elektroanalitik yaitu amperometri,

voltametri, kulometri dan konduktometri. Detektor berdasarkan potosiometri kurang

praktis untuk keperluan KCKT karena elektrode potensiometer memerlukan waktu

adaptasi yang relatif lama.

6. Detektor spektrometrik massa

Efluen dari KCKT tidak dimasukkan langsung ke dalam spektrometer massa karena

volume fasa gerak relatif sangat besar jika dibanddingkan dengan analit, melainkan

melalui suatu antarmuka. Pada salah satru antar muka, aliran eluen dari kolom

dipecah, dan hanya sebagian kecil saja yang diinjeksikan ke dalam spektrometer

massa. Pada antar muka yang lain, efluen dari kolom dibawa ke ruang penguapan

menggunakan sitem ban berjalan. Setelah solven diupkan, analit dimasukkan ke

dalam ruang pengion dan diionkan dengan teknik desorpsi medan.

7. Detektor spektrometerik massa

Detektor spektrometerik massa secara mutlak memerlukan sistem terkomputerisasi

untuk menyimpan dan mengolah data serta untuk mengontrol sistem kerja

antarmuka dan sepektrometer massa.

k. Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing

puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap


sinar UV. Sepanjang mengontrol kondisi kolom, dapat menggunakan waktu retensi

untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya sudah

mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang

sama. Mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan dapat menggunakan

puncak.

Contoh :

Senyawa tertentu, X, jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung

senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak

hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga

dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa

yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui

detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.

Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat

sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun

waktu retensi akan sama. Misalnya gambar yang dihasilkan :

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan

untuk mengetahui berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam

jumlah kecil. Meskipun demikian, harus berhati-hati.

Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan

Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya

jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.


Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area

dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari

X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang

gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar

Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan

puncak yang kecil.

2. LEMBAR KERJA

3. EVALUASI

1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan waktu retensi. dan bagaimanan

cara pengukurannya terhadap sampel yang dianalisis dengan KCKT!

2. Jelaskan perbedaan dua fase dalam KCKT, sehingga tergantung pada

polaritas relatif dari pelarut dan fase diam!

3. Jelaskan fungsi dan syara-syarat pompa pada KCKT!

4. Apa yang dimaksud dengan Pompa balas (reciprocating pumps) dan

jelaskan kelemahan dan keunggulannya!

5. Sebutkan 5 jenis ditektor KCKT

D. KEGIATAN PEMBELAJARAN 4. MELAKSANAKAN PENGUKURAN

ANALISIS

1. LEMBAR INFORMASI

a. Analisa Kualitatif pada GLC


Tujuan dari analisa kualitatif pada GLC adalah i den t i f i kas i dari suatu

komponen atau lebih dari suatu cuplikan. Hal ini terutama dilakukan dengan

membandingkan dengan senyawa-senyawa referensi standard. Pada

dasarnya kita dapat menyatakan satu hal secara absolut dalam analisa

kualitatif dalam GLC.

Dua senyawa tidak sama jika mereka mempunyai karakteristik GLC berbeda.

Jika suatu senyawa yang tak/belum diketahui adalah kemungkinan senyawa A,

dan kemudian meninjeksikan senyawa murni A sebagai senyawa referensi,

makam akan mendapatkan dua kemungkinan :

1. Data GLC, kebanyakan menggunakan retensi, adalah tidak sama, maka

kesimpulannya : senyawa-senyawa tersebut tidak sama.

2. Data GLC adalah sama : kedua senyawa mungkin mirip/sama, tetapi

dapat berbeda sungguh-suugguh. Sehingga keduanya tidak sama.

Jika kita ingin menguji dengan GLC bahwa dua senyawa adalah sama, maka

kita memerlukan :

a. Melakukan analisa dua kali pada dua kolom yang berbeda.

b. Dua analisa yang lain pada dua suhu yang bcrbeda.

Juga perlu untuk suatu teknik yang disebut "Sp ik ing" di mana Jika kemudian

ternyata bahwa waktu retensinya sama, maka kita dapat mengatakan bahwa

dua senyawa adalah sama. Pada dasarnya pekerjaan ini kita menambahkan

cuplikan standard. Pada dasarnya kita dapat membandingkan waktu retensi.

Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan untuk mengelusikan senyawa

setelah diinjeksikan. Waktu retensi dari suatu senyawa dapat diulang dengan

hasil yang sama. Tetapi tidak terkoreksi jarang digunakan, karena tergantung

pada :

1) Panjang dan diameter kolom

2) fasa cair (jenis clan jumlah)

3) suhu kolom

4) kecepatan aliran

5) jenis dari gas pengangkut

6) "dead volume" dari peralatan.


Waktu retensi yang diatur hanya untuk pengaturan "the instrument's dead

volume". Hal inipun juga jarang digunakan untuk identifikasi.

Cara yang paling baik adalah menggunakan waktu retensi relatif. Waktu

retensi ini relatif terhadap suatu senyawa standar. Yang lebih baik digunakan

adalah waktu retensi relatif yang terkoreksi (diukur dari puncak udara) :

Waktu retensi relatif (adjusted) hanya tergantung pada :

1) suhu kolom ,

2) jenis dari fasa diam.

b. Analisa Kuantitatif dalam GLC

Analisa kuantitatif dalam GLC berarti menentukan jumlah (%) dari

komponen-komponen yang terpisah dari suatu cuplikan. Hal ini didasarkan

pada suatu kenyataan bahwa pencatat menghasilkan sinyal atau puncak

yang sebanding dengan suatu sifat dari molekul-molekul cuplikan. Pada

katharometer yaitu tahanan panas, dalam detektor ionisasi nyala yaitu

udara

injeks

i

t’A

tA t’X

tX

A=

Senyawa standar

X=

Tak diketahui tX

hingga waktu retensi relative =

tA

t’X

waktu relative terkoreksi (adjusted) =

t’A


ionisasi, dan dalam EC yaitu penangkapan elektron-elektron oleh molekul-

molekul cuplikan.

Respon/jawaban detektor, dibuat nyata oleh pencatat, dapat diubah

menjadi konsentrasi atau berat dari suatu komponen dari cuplikan. GLC

merupakan bagian yang paling besar digunakan dalam penentuan

konsentrasi atau berat dari senyawa-senyawa.

1. Batasan-batasan dalam Analisa Kuantitatif pada GLC

Kisaran konsentrasi adalah sangat terbatas bandingkan sebagai contoh,

pengukuran-pengukuran konsentrasi pada U.V. (hukum Lambert-Beer 0,5

<E <1.0).

Demikian juga dalam detektor GC berada dalam jangkauan linier, hanya

dalam kisaran konsentrasi iertentu. Ini berarti, misalnya jika kita

mendapatkan puncak dengan luas 20 mm2 dari senyawa 10 pg, maka kita

harus mernperoleh luasan puncak sebesar 40 mm2 untuk 20 pg, jika kita

berada dalam kisaran linier, meskipun demikian tidak berarti bahwa 10 mg

akan menghasilkan luasan puncak 20.000 mm2. Mengapa ? Kita harus

mengetahui kisaran linier suatu detektor.

Kisaran linier detektor adalah perbandingan dari konsentrasi yang terbesar

dengan yang terkecil.

Detektor Kisaran linier Sensitivitas

- T.C.D. 104 6.10I°g/det

- F.I.D. 107 10'1 g/det

- E.C.D. 102 10-14 g/det

2. Respon Jawaban detektor

Jenis detektor yang berbeda akan memberikan reaksi yang berbeda

terhadap komponen-komponen dari cuplikan. Ini berarti bahwa respon dari

TCD terhadap 20 mg hexan akan berbeda bila kita menggunakan FID.

Juga untuk hexan sebanyak 20mg.

Tetapi ternyata juga satu jenis detektor akan memberikan respon yang

bcrbcda terhadap senyawa-senyawa yang berbeda. Sehingga TCD (atau

FID atau ECD) dapat memberikan luasan puncak yang berbeda terhadap


20 mg hexan dan 20 mg etanol. Itulah sebabnya kita harus

menstandarisasi, seperti yang akan dibicarakan kemudian. Tetapi

sebelumnya kita perlu mengetahui bagaimana cara mengukur puncak-

puncak pada suatu kromatogram.

3. Pengukuran Puncak (pik)

a. Ketinggian puncak

Ini merupakan cara yang paling mudah dan cepat. Kita dengan mudah

mengukur..ketinggian dari atas suatu puncak sampai ke garis dasar. Untuk

memperoleh garis dasar kita harus menarik garis yang paling baik antara

permulaan dan akhir dari puncak.

1. Pengukuran ketinggian

Ketinggian selalu dinyatakan dalam mm. Cara ini dapat dipertanggung

jawabkan untuk cuplikan sebanyak < 10 Pg.

2. Luas puncak

Cara ini merupakan cara yang paling banyak digunakan baik dengan

tangan atau dengan mesin/secara otomatik, yang dikenal juga dengan

nama integrator.

a. Tinggi x lebar pada setengah tinggi

Puncak-puncak pada kromatogram mirip seperti segi tiga. Cara ini

mendekatkan puncak (bentuk bel) sebagai segi tiga :

http://digunakan.la/


w = lebar pada ½ H

Luas = H x W (dalam mm2 atau cm2 )

Dasar puncak normal tidak diberikan karena dapat terjadi deviasi yang besar

pada puncak-puncak yang tidak simetris.

b. Penimbangan

Integrator, lntegrator-integrator menghitung secara otomatis luas permukaan

dari puncak-puncak. Ada dua macam integrator yaitu :

1. Integrator piringan yang bekerja secara mekanik.

2. Integrator digital/angka elektronik merupakan integrator yang paling

baik, tetapi agak mahal. Alat ini mulai dan berhenti mengintegrasi secara

otomatik, memberikan harga-harga untuk luasan dan kadang-kadang

mencatat juga waktu retensi.

4. Faktor-fak(or Koreksi

Faktor-faktor koreksi harus ditentukan karena senyawa-senyawa yang

berbeda mempunyai respon terhadap detektor berbeda pula. Faktor- relatif,

misal : terhadap benzena atau terhadap kornponen lain dari cuplikan. Faktor

yang terakhir ini merupakan bilangan sembarang terhadap 1.0.

pelarut benzan

a

Komponen cuplikan

yang diukur


Cara :

1. Timbang secara teliti campuran benzena + cuplikan (W).

2. Masukkan/injeksikan dan ukur luasan puncak (A).

3. Hitung A/W untuk puncak cuplikan dan untuk puncak bezana

4. Faktor koreksi untuk puncak cuplikan, relative untuk bezana

Sejauh kertas pencatat mempunyai homogenitas yang tinggi sehingga berat

dari suatu puncak sesuai dengan berat dari komponen cuplikan. Kita dengan

mudah menggunting puncak-puncak

A/W (cuplikan)

= A/W (benzena)

Untuk cuplikan dan detektor yang spesifik faktor-faktor koreksi berikut ini

selalu dapat digunakan.

Contoh :

untuk FID senyawa

faktor koreksi

benzena anilin asam asetat etanol

1.00 0.46 0.24 0.75

5. Standardisasi

Disebabkan respon-respon yang berbeda dari detektor tertentu terhadap

senyawa-senyawa organik, maka harus menggunakan senyawa standar.

Dengan standar dapat menghitung faktor-faktor koreksi. Persyaratan

terhadap standar adalah :

1. sangat murni

2. inert

3. bercampur dengan cuplikan

4. tidak mudah menguap

5. stabil.

Dua cara standardisasi yang biasanya digunakan :


a. Standardisasi eksternal

b. Internal,

a. Standardisasi eksternal

Standarisasi eksternal jumlah yang pasti dari cuplikan murni diinjeksikan.

Harga-harga dari luasan puncak kemudian digambarkan lawan berat-berat

senyawa yang diketahui dan diinjeksikan.

Dalam praktek kita mengerjakan sebagai berikut :

1. Buat larutan 10 % dari cuplikan A

2. Buat dari larutan ini : larutan-larutan 5 : 1 : 0,5 : 0,1%.

3. Injeksikan larutan tersebut , hitung luasan-luasan puncak

4. Buat kurva kalibrasi

catatan : Perhatikan kelinieran dari sistem GLC untuk larutan-larutan tersebut.

lni berarti bahwa :

area/luas

= konstan (c); untuk semua larutan Konsentrasi

Konsentrasi dari cuplikan A yang tidak diketahui, sekarang dapat ditentukan

dari kurva kalibrasi, atau dari perumusan

Berat cuplikan

Luas

puncak


Ketidak keuntungan dari cara ini adalah

1. Jumlah yang tepat dari cuplikan harus diinjeksikan

2. Penginjeksian yang dapat hasil-ulang (reproducible)

3. Kalibrasi adalah waktu yang diperlukan.

4. Sensitifitas detector harus tetap konstan

b. Standardisasi internal

Cara ini mempunyai keuntungan utama yaitu tidak memerlukan volume

yang diketahui untuk diinjeksikan. Sehingga tidak membutuhkan

penginjeksian yang dapat diulang

Cara standardisasi internal memberikan persentase berat yang sangat tepat

terhadap komponen-kornponen cuplikan. Caranya adalah sebagai berikut :

Cara ini tidak sensitif relatif terhadap perubahan-perubahan dalam sistem

kromatografi (aliran, kolom, detektor). Standar internal yang dipilih harus

mempunyai syarat :

a. kira-kira sifat kimia yang sama seperti cuplikan,

b. kira-kira waktu retensi yang sama seperti senyawa cuplikan, waktu

retensi tidak tepat sama (tidak bersamaan dengan suatu komponen dari

cuplikan).

c. Waktu retensi tidak sama (tidak bersamaan dengandengan suatu

komponen dari cuplikan)

Cara standarisasi internal memberikan prosentase berat yang sangat tepat

terhadap komponen-komponen cuplikan. Caranya adalah :

1. Tambahkan pada cuplikan dengan berat yang tepat sejumlah standar

internal, juga berat yang tepat dengan konsentrasi kira sama (biasanya

10%).

2. Tentukan faktor-faktor koreksi dalam suatu analisa yang terpisah, untuk

semua komponen cuplikan yang diukur.

3. Persen berat dari setiap komponen cuplikan dapat dihitung dengan :

luas senyawa x berat standar int. x 100

% berat = faktor koreksi x luas standar int. x Berat cuplikan


6. Kesalahan-kesalahan dalam Analisa Kuantitatif

Kemungkinan kesalahan-kesalahan pada analisa GLC dapat timbul dari :

I. Cara penyiapan cuplikan

a. Penginjeksian yang baik adalah merupakan "seni" yang harus

dipelajari.

b. Cuplikan dapat berubah dalam GLC : hilangnya komponen yang

dihasilkan dalam analisa kuantitatif yang jelek.

2. Penampilan detektor

Detektor-dctektor menjadi kotor atau pengaturannya yang tidak baik

3. Penampilan : Pencatat harus berada dalam kisaran linier (zero-set)

4.Cara kuantitatif

5. Penghitungan

Dari 1 - 4 telah banyak kita bicarakan, sekarang kita akan meninjau

kesalahan-kesalahan yang disebabkan oleh penghitungan. Didalam

penghitungan GLC kita sering bekerja dengan :

pengukuran-pengukuran yang ditambahkan

Harga rata-rata (X) : jumlah total pengukuran

Deviasi standar : σ =

Deviasi standar menunjukkan pengukuran-pengukuran yang lebih baik

daripada penghitungan rata-rata.

Deviasi standar relatif didefinisikan sebagai :

σ

σ rel = x 100% X

7. Analisis Berdasarkan Tinggi Pik

Tinggi pik kromatografi dapat diperoleh dengan menghubungkan garis

dasar (base line) di kedua sisi pik dengan satu garis lurus dan

mengukur jarak garis ini ke puncak pik, pengukuran ini bisa dilakukan


dengan tingkat presisi yang cukup tinggi. Perlu diperhatikan bahwa

tinggi pik dipengaruhi oleh pelebaran zona, yaitu tinggi pik berbanding

terbalik dengan lebar pik. Pengukuran berdasarkan tinggi pik hanya

bisa dilakukan jika lebar pik standar dengan lebar pik sampel relatif

sama. Untu memperoleh kondisi ini yang perlu diatur adalah temperatur

kolom, kecepatan alir fasa gerak dan rentang injeksi sampel. Jumlah

sampel yang diinjeksikan tidak melampaui batas maksimal (tidak

overload).

2. LEMBAR KERJA Peserta dibagi menjadi 3 kelompok, setiap kelompok mendiskusikan tugas dibawah ini : 1. Diskusikan dengan teman Anda apa yang akan terjadi jika dalam

analisis dengan GLC jumlah sampel yang diinjeksikan melampaui

batas maksimal (tidak overload).

2. Tinggi pik kromatografi dapat diperoleh dengan menghubungkan garis

dasar (base line) di kedua sisi pik dengan satu garis lurus dan

mengukur jarak garis ini ke puncak pik, pengukuran ini bisa dilakukan

dengan tingkat presisi yang cukup tinggi. Gambarkan dengan

kromatogram, sehingga luas pik dapat dihitung dengan cara

menghitung luas segitiga yang terbentuk dari alas pik dan puncak pik.

3. Kromatografi gas telah digunakan secara berhasil terhadap sejumlah

besar senyawa-senyawa dalam berbagai bidang. Dan digunakan baik

terhadap senyawa-senyawa organik dan anorganik. Jelaskan beberapa

contoh kegunaan kromatografi gas pada bidang-bidang yang besar ruang

lingkupnya.

4. Diskusi kelompok diberi waktu 20 menit, dan setiap kelompok

mempresentasikan hasilnya selama 10 menit.

3. EVALUASI

1. Jelaskan tujuan dari analisa kualitatif pada GLC!

2. Kemungkinan-kemungkinan apa saja yang dapat menimbul

kankesalahan pada analisa dengan GLC!

http://bidang.la/


3. Jelaskan cara standardisasi internal dapat memberikan persentase berat

yang sangat tepat terhadap komponen-kornponen cuplikan!

4. Jelaskan syarat-syarat standarisasi internal yang dipilih dalam sistem

kromatografi (aliran, kolom, detektor)!

E. KEGIATAN PEMBELAJARAN 5. MELAKSANAKAN PERHITUNGAN ANALISIS


1. LEMBAR INFORMASI

a. Dasar kerja Kolom GLC

Meskipun teori GLC agak sukar namun demikian dasar kerjanya sangat

mudah. Pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi di antara gas

pengangkut dan fasa cair. Berikut adalah apa yang terjadi yang dinyatakan

dalam skala waktu.

Cuplikan yang dimasukkan mengandung komponen A+B+C

Waktu nol

A

B

C

2 menit

B

C

A

A terpisah dari

B dan C

4 menit

C

B

A

Sekarang A,B

dan C terpisah

Bagaimana pemisahan ini dapat terjadi ?

Kenyataan proses GLC adalah mirip dengan ekstraksi. Proses pemisahan

dapat dipandang sebagai serangkaian dari partisi di mana cuplikan masuk

ke dalam larutan dari fasa dan selang beberapa waktu akan teruapkan lagi.

● * ▪

● ▪

Molekul

cuplikan

Fasa bergerak


Jadi fasa cair menahan molekul-molekul cuplikan. Gerakan dilakukan oleh

fasa bergerak. Afinitas cuplikan terhadap fasa cair menentukan berapa lama

cuplikan dItahan. Senyawa-senyawa yang mempunyai afinitas rendah (tidak

suka) terhadap fasa diam akan keluar dari kolom pertama. Sedangkan

senyawa-senyawa dengan afinitas besar (larut dengan baik) terhadap fasa

diam akan keluar dari kolom berikutnya.

Afinitas ini didasarkan pada kelarutan dari cuplikan terhadap fasa diam:

2. Fasa diam melarutkan cuplikan.

3. Semua molekul cuplikan bergerak dengan kecepatan absolut yang sama

melalui kolom, yaitu sesuai dengan kecepatan gas pengangkut.

4. Kecepatan relatif dari molekul-molekul cuplikan adalah berbeda,

disebabkan afinitas yang berbeda.

Jika kita masukkan senyawa tunggal ke dalam GLC, maka senyawa tersebut

akan teruapkan dan terlarut (tercampur) dalam gas pengangkut. Jika

senyawa ini masuk ke dalam kolom, ia akan ditarik oleh fasa cair (stasioner).

Kemudian, akan dipartisikan sesuai dengan hukum NERNST.

Hukum NERNST menyatakan :

konsentrasi senyawa dalam fasa diam K = konsentrasi senyawa dalam fasa bergerak

Harga K tergantung pada :

1. Volatilitas kemudahan menguap dari senyawa.

2. Afinitas dari cuplikan terhadap fasa diam.

Keterangan :

1. Volatilitas terutama tergantung pada titik didih dari senyawa.

2. Afinitas didasarkan pada interaksi antara cupCkan senyawa dengan fasa

diam.

Molekul cuplikan dalam fasa

cair

Molekul-molekul yang teruapkan

Fasa cair

Padatan

pendukung


Interaksi-interaksi tersebut merupakan gaya molekular. Gaya yang kita

kenal adalah :

a. Gaya van der Waals = gaya dispersi (non polar).

b. Ikatan hidrogen = gaya Keesom (merupakan interaksi antara dua dipol

yang permanen).

c. Interaksi dipol terinduksi (gaya Debye), merupakan hasil interaksi antara

dipol permanen dengan dipole terinduksi.

d. Gaya interaksi spesifik, seperti ikatan kimia atau pembentukan komplek

Ikatan hidrogen (b) merupakan gaya yang penting dalam GLC, sedangkan

(d) hampir tidak terdapat pada GLC, tetapi penting terutama dalam

kromatografi penukar ion.

Jika harga k tetap pada kisaran konsentrasi yang besar, maka kita akan

mendapatkan : LINEAR GLC.

Kondisi untuk GLC linier yang ideal diperoleh jika :

1. Kesetirnbangan dicapai sangat cepat pada setiap saat.

2. Molekul-molekul cuplikan hanya bergerak oleh gaya dari gas

3. Pengangkut; sehingga tidak ada difusi.

4. Pengisian dari kolom harus sama/uniform (setiap bagian mengandung

jumlah sama fasa diam clan fasa bergerak).

Dalam hal cuplikan mengandung lebih dari satu senyawa, maka setiap

senyawa akan mempunyai harga k sendiri-sendiri. Sebagai contoh,

bayangkan suatu cuplikan mengandung molekul-molekul A, B, C, dan D,

maka kita akan memperoleh 4 harga K, : kA, kB, kC, dan kD.

Kecepatan di mana molekul-molekul tersebut bergerak melalui kolom sama

dengan hasil kali kecepatan gas clan bagian dari waktu dalam mana

komponen-komponen tersebut dalam fasa gas. Bayangkan kromatogram

berikut :


Udara (N2) mempunyai titik didih yang sangat rendah, tidak ditahan oleh fasa

cair.

tR = waktu aatam mana senyawa tetap tinggal.

tR - f' R = waktu dalam mana senyawa bergerak.

Di dalam GLC kita akan banyak bee-bicara tentang dalam mana cuplikan

ditahan oleh kolom; ini disebut pe,7ahanan (the retention time) = tR.

Kromatogram gas dari GLC linier yang ideal untuk hasil analisa empat

senyawa A, B, C, dan D akan memberikan gambaran seperti berikut :

hingga ia

Kita selalu mempunyai G1.C linier yang tidak ideal, karena kolom yang ideal

tidak terdapat. Kalau kita lihat pada kromatogram gas normal, tidak ada

puncak-puncak kecil, tetapi berupa bentuk-bentuk kurva, yang disebut kurva-

kurva Gauss, (pelebaran puncak), atau bila keadaannya lebih jelek akan

menghasilkan puncak-puncak berekor atau pemanjangan di muka.

Hal ini disebabkan adanya :

1. Difusi eddy (olakan) : difusi ini disebabkan oleh kenyataan bahwa

kecepatan gas pengangkut tidak sama di dalam seluruh kolom. Ini

disebabkan oleh kenyataan bahwa bagian-bagian dari pori yang dilalui

tidak sama panjang :"MULTIPATH -EFFECT" (pengaruh jalan berganda).

Senyawa dalam fasa cair

dalam masa ini Senyawa bergerak dalam masa

ini

Senyawa bergerak Senyawa tetap

tinggal

waktu

waktu

A B C

D


2. Difusi molekuler : terutama dalam fasa gas, molekul-molekul cuplikan

dapat bergerak dalam arah yang salah yang disebabkan oleh difusi.

3. Kesetimbangan yang lambat : beberapa molekul tetap tinggal lama,

lainnya sebentar dalam fasa diam (hal ini dapat disebabkan oleh

perbedaan-perbedaan suhu yang kecil).

4. Harga k tidak tetap : ini disebabkan perbedaan rasio distribusi dalam

kolom.

Keempat faktor ini menyebabkan perbedaan puncak. Faktor- Faktor 1,2,3

menyebabkan faktor puncak yang simetris. Faktor 4 menyebabkan pelebaran

puncak yang tidak simetris.

Pelebaran-pelebaran puncak terjadi dalam berbagai cara/metoda analisa

(misal dalam spektroskopi). Dalam keadaan yang paling buruk dapat

menyebabkan puncak-puncak saling tindih.

Kita mendifinisikan pemisahan R (resolution), sebagai pemisahan

nyata antara dua puncak berdekatan :

R = 2 d dalam hal dua puncak dengan luas sama.

WI+W2

Jika R = 1 pemisahan adalah 98%.

Untuk pemisahan yang baik R harus : R > 1,5, ini berarti pemisahan >

99,7%a.

Pemisahan dari puncak-puncak dalam Kromatografi erat hubungannya

dengan dua faktor:


1. Ejfisiensi kolom : pelebaran puncak merupakan hasil dari bentuk

kolom dan kondisi operasi.

2. Effisiensi pelarut : hasil dari interaksi antara cuplikan dengan fasa

diam, effisiensi pelarut menentukan kedudukan relatif dari jalur-

jalur solute pada sebuah kromatogram

a. Effisiensi Kolom

Effisiensi kolom diukur sebagai jumlah pelat teoritis : N. Kita berbicara

tentang "The height equivalent to a theoretical plate, the HETP"

(ketinggian ekuivalen terhadap pelat teoritis) dan didefinisikan

sebagai :

L

HETP =

N

N = jum(ah pelat teoritis dari suatu kolom

L = panjang (cm) dari kolom tersebu.

Effisiensi kolom tergantung pada :

pelarut = fasa diam

solute/zat yang dilarutkan = cuplikan

suhu

kecepatan aliran (dari gas pengangkut)

ukuran dari cuplikan.

Banyak faktor yang mempengaruhi N (atau HETP). Tetapi secara

kuantitatif teori yang menyatakan efek-efek tersebut adalah sangat

sukar. Kita akan membicarakan dua teori :

A. Teori pelat

B. Teori kelajuan/kecepatan.

.

b. Teori Pelat


Konsep tentang pelat adalah imaginasi : suatu kolom GLC tidak

memiliki pelat-pelat, tetapi merupakan penggambaran dari partikel--

partikel (bentuk bulatan) yang tertarik/terikat fasa cair seperti halnya

dalam GLC. Dasar teori pelat adalah dari distribusi.

Pelat, atau lebih baik HETP, adalah tinggi (atau panjang) dari kolom

yang cukup untuk tercapainya kesetimbangan antara solute dalam

fasa gas bergerak dan fasa cair yang tetap. Lebih banyak pelat yang

dimiliki oleh kolom, akan memberikan puncak yang lebih kecil, atau

efisiensi kolom lebih baik.

Contoh : Pelat teoritis N.

Efisiensi kolom naik jika jumlah pelat teoritis lebih.

Dari tabel berikut kita dapat melihat harga dari kromatografi gas sebagai

alat analisa :

Ettsiensi

Panjang

umumnya

Jumlah

pelat

Vigreux 2,5/ft 2 ft 5

Spinning band 75 /ft 2 ft 150

Kolom GLC 500 /ft 6 ft 3.000

Kapiler gelas GLC 200 /ft 150 ft 30.000

Pelat teoritis berhubungan dengan pelebaran puncak pada

kromatogram. Sehingga mudah menghitung jumlah pelat, N dari

kromatogram.

di mana :

x = jarak dari injeksi ke puncak maksimum.


y = panjang dari garis dasar yang terpotong oleh tangen-tangen dari

kurva pada titik-titik pertemuan (biasanya 2/3 dari tinggi).

perumusan yang disederhanakan ini berasal dari hasil teori pelat :

xN = x2 , dimana σ = deviasi standar dari

a

a= (x-x)

n-1

hingga N = x , = x2 (n-1)

(x-x)2 (x-x)2

n-1

dimana x = harga rata-rata perhitungan dari x

n = jumlah yang terhitung

W = 2.30 q dimana W = lebar puncak pada I/2 H

Bila W = 2,36 disubstitusikan dalam

memberikan 2,36 X

N=()2 = 5,57 ()2

W W

Perumusan ini lebih teliti untuk menghitung N daripada perumusan :

X X

N = 16 ()2; ini berasal : N=()2

y W

N= X2

O2


dimana y = 4 σ

Dari kromatogram kita kemudip.n dapat menghitung HETP dengan rumus :

L σ 2

HETP = = L N X2

(L selalu spesifik untuk suatu kolom).Jumlah pelat teoritis tiap meter dari

panjang kolom disebut :"Performance" dari kolom.

c. Teori kelajuan dan percepatan

Teori kelajuan telah dikembangkan oleh seorang Belanda Van Deemter,

persamaan yang diturunkannya disebut : Persamaan Van Deemter.

Bentuk persamaan tersebut adalah :

HEPT=A+B/µ + C.µ

Persamaan ini memberikan jawaban bagaimana untuk meningkatkan

peranan kolom Kromatografi.

µ adalah kecepatan linier gas (atau kelajuan ali ran) melalui kolom;

µ diukur dengan :

panjang kolom (dalam cm)

µ= waktu penahanan udara (dalam detik)

Besaran-besaran A, B. dan C penyebab utama terjadinya pelebaran puncak :

(A). Difusi olakan (the eddy diffusion) = (efek jalan ganda)

Penggambaran perbedaan panjang jalan dalam suatu kotom.

(B). Difusi molekuler; pendefusian solute dalam gas pengangkut.


(C). Penahanan terhadap perpindahan massa

Ini adalah ukuran dari jumlah atau kekentalan dari fasa diam (cair) di dalam

kolom GLC.

Jika harga-harga A, B, dan C tertentu, maka kita dapat melihat persamaan

dasar van Deemter harus terdapat kecepatan kelajuan gas pengangkut

optimum, di mana kita akan bekerja pada keadaan tersebut.

Katakanlah dengan HETP minimum :

HETP = A + B/µ + C.µ

HETP Min = A+ 2B.C

Besaran-besaran yang tepat A, B, dan C dapat ditentukan dari penurunan

persamaan van Deemter. Namun hanya akan meringkas secara praktis agar

supaya meningkatkan efisiensi kolom.

1. Padatan pendukung harus terbuat dari partikel-partikel yang kecil,

ukurannya sama; biasanya dari tanah diatomea yang mempunyai ukuran

100 - 120 mesh.

2. Kecepatan alir gas pengangkut adalah optimum pada HETP minimum.

3. Gas pengangkut dengan berat molekul besar, biasanya N2, untuk analisa

yang cepat dapat digunakan He atau H2

4. Fasa diam yang digiznakan harus mempunyai kekentalan rendah.

5. Banyaknya/jumlah fasa diam yang dipakai biasanya 1 -10% dari berat

padatan pendukung.

6. Perbandingan antara gas pengangkut yang masuk dan yang keluar harus

rendah; tekanan yang masuk 1,5 - 2,5 atm.

Fasa cair gas

pengangkut

Defuse molekul solute kolom


7. Pemisahan akan lebih baik pada suhu kolom yang rendah tetapi dengan

demikian waktu analisa menjadi lama.

8. Diameter kolom yang kecil memberikan pemisahan lebih baik (I/8" atau

1/16 inch).

Delapan aturan tersebut akan menaikkan efisiensi kolom, sehingga puncak-

puncak yang terjadi akan sekecil mungkin. Tetapi masih mempunyai dasar

lain untuk menaikkan pemisahan dalam GLC.

d. Efisiensi Pelarut

Suatu hal yang penting dari GLC, bahwa GLC dapat memisahkan senyawa-

senyawa dengan tekanan uap yang sama, yaitu yang mempunyai titik didih

yang sama. Pekerjaan tersebut tak mungkin dilakukan dengan distilasi.

Hal ini dirnungkinkan oleh kenyataan bahwa GLC memiliki fasa cair, yaitu

pelarut (fasa diam). Seperti telah kita ketahui, pelarut mempunyai interaksi yang

spesifik dengan cuplikan. Gaya-gaya ini rnenentukan kelarutan hingga dengan

demikian pemisahan dapat terjadi. Pemisahan tergantung pada harga-harga

koefisien partisi K.

Efisien pelarut didefinisikan sebagai : perbandingan dari koefisien-koefisien

partisi, atau waktu-waktu retensi yang teratur.

x, , x = waktu retensi (volume) dari puncak 1, 2.

x,, x, = waktu retensi terkorelasi atau diatur dari puncak 1, 2.

x 2 k2

Efisiensi pelarut, a = = x 1’ k1


x2

Kita juga mendefinisikan : Faktor Pemisahan, SF= x2

Koefisien distribusi (= partisi), k, tergantung pada suhu. Harga k turun dengan

kenaikan suhu, karena molekul-molekul akan lebih lama berada dalam fasa

gas pada suhu yang lebih tinggi.

k2

Karena efisiensi pelarut, α = , α tetap pada kisaran suhu tertentu. k1 Meskipun demikian, pada suhu-suhu yang relatif tinggi, harga k menjadi

sangat kecil, hingga pemisahan akan menurun, karena pemisahan hanya

terjadi dalam fasa cair. Dan pada harga-harga k kecil, kebanyakan molekul-

molekul solute berada dalam fasa gas. Sehingga untuk mencapai pemisahan-

pemisahan GLC yang lebih baik suhu-suhu yang lebih rendah harus

digunakan.

Waktu minimum yang dihabiskan dalam fasa cair rata-rata 50% dari waktu

retensi. Ini berarti bahwa tR adalah lebih dari dua kali harga dari waktu retensi

udara. Hingga kromatogram yang baik mempunyai bentuk seperti ini :

Sekarang kita mendefinisikan faktor kapasitas untuk suatu pemisahan :

waktu retensi terkoreksi x2

K2’= waktu retensi udara

Daerah kromotogram untuk

pemisahan puncak yang baik

Disini tidak ada

puncak-puncak

puncak

Puncak

udara Udara

injeksi


Dari perumusan berikut kita akan dapat menghitung pelat teoritis yang

dibutuhkan, jadi panjang yang dibutuhkan untuk pemisahan yang baik, adalah

menghitung jumlah suatu kolom, yang baik :

α K2’ + 1

N yang dibutuhkan = 16 R2 ( )2 =( )2

α - n K2’

R = pemisahan (resolution)

α = efisiensi pelarut.

e. Suhu Kolom

Suhu kolom merupakan hal yang penting dalam pemisahan-pemisahan GLC.

Tetapi suhu kolom tidak dapat dipilih. Koefisien partisi, k, sangat tergantung

pada suhu. Sebagai aturan umum dapat dinyatakan sebagai berikut : Kenaikan

sebesar 30o C dalam suhu kolom akan menurunkan setengah harga k, jadi

menurunkan juga setengah dari waktu retensi, hingga suhu-suhu kolom yang

lebih tinggi akan menurunkan waktu analisa. Tetapi, biasanya pemisahan

dapat ditingkatkan dengan penurunan suhu kolom. Ini berarti harus ada suhu

kolom optimum dalarn analisa GLC.

Pada umumnya ada aturan yaitu : Suhu kolom yang paling baik adalah harga

rata-rata dari titik didih dari cuplikan. Tentu saja hal inipun masih tergantung

pada persentase dari fasa cair pada padatan pendukung. Jumlah yang tinggi

dari fasa cair akan memerlukan suhu kolom yang lebih tinggi.

Dalam menentukan suhu kolom harus memperhatikan suhu maksimum yang

diperbolehkan dari fasa cair yang digunakan, terjadi"colum bleeding" (=

penguapan dari fasa diam). Meskipun demikian setiap suhu yang digunakan

harus di atas titik lebur dari senyawa atau cuplikan.

Puncak

udara

injeksi

X2’

x

udar

a


GLC berkembang sangat cepat, saat sekarang telah ada beberapa ratus fasa

diam. Karena banyaknya jenis fasa diam sering kesukaran dalam memilih

fasa cair yang dipersyaratkan untuk pemisahan.

f. Pemilihan yang tepat fasa diam untuk GLC

Pendugaan secara kuantitatif terhadap waktu retensi tetap merupakan

persoalan yang sangat sukar dalam teori GLC. Di dalam praktek tidak

membutuhkan pendugaan tersebut, karena dalam kebanyakan analisa GLC

bekerja dengan senyawa-senyawa yang tidak diketahui.

Untuk pemisahan dengan GLC terhadap senyawa-senyawa organik bekerja

dengan kaidah/aturan yang agak sederhana : "like dissolves like" (Latin

Similia similibus solventur). Keadaan ini sesuai dengan aturan dalam pemilihan

pelarut untuk sejenis senyawa organik yang tertentu.

Dalam GLC hal ini terutama didasarkan pada cuplikan larutan dalam fasa cair.

Dimana polaritas dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk

memperoleh pemisahan GLC yang baik. Sehingga senyawa polar akan

terpisah dengan baik pada fasa cair yang polar dan senyawa-senyawa yang

non-polar akan terpisah dengan baik pada fasa cair non-polar.

Berikut kita bagi fasa diam menjadi tiga kelompok :

1. Non polar

2. Semi polar (antara I dan 3)

3. Polar.

1. Fasa cair non polar

a. Fasa cair non polar yang terkenal adalah : APIEZON. Apiezon merupakan

suatu campuran dari alkana-alkana dengan titik didih yang sangat tinggi;

CnH2n+2, di mana n sangat besar.

b. Juga sangat dikenal : Squalane. Ini adalah hidrokarbon : hexametil

tetrakosaan, C3pH62,

c. Juga banyak digunakan karet silikon yang disebut : SE - 30; yang

merupakan polimer.

Pada umumnya fasa -fasa cair non polar memisahkan kumponen-

komponen cuplikan sesuai dengan titik didihnya.


2. Fasa cair semi polar

Fasa cair semi polar terdiri dari rantai non polar yang terikat pada

gugus-gugus polar atau dapat menjadi polar, yang sering digunakan

adalah ester-ester dari asam ftalat dan alkulrol-alkohol tinggi; misal

dionilftalat.

O װ C -O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3

C-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 װ O

Fasa cair yang dikenal dengan nama dagang ; SAE-52, merupakan

polimer dengan silikon dengan struktur :

CH3 CH3 Ι Ι

Si -0- Si -O Ι Ι CH3 CH3 n

Fasa semi polar ini ternyata mempunyai kemiripan dengan fasa-fasa

non polar, yang memisahkan senyawa-senyawa polar dan non polar

sesuai dengan berat molekul, jadi sesuai juga dengan titik didihnya.

Campuran dari senyawa-senyawa polar dan non polar juga terpisahkan

sesuai dengan berat molekulnya. Hingga jika titik didih senyawa

tersebut sama, maka senyawa yang polar akan mempunyai waktu

retensi yang paling rendah/pendek. Ini disebabkan dengan ti tik didih

yang sama, senyawa yang polar akan mempunyai berat molekul yang

paling rendah.

2. Fasa Cair Polar

Fasa-fasa cair polar mengandung gugus-gugus polar. Fasa cair polar

yang terkenal adalah polieter. Carbowax termasuk dalam golongan ini.

Carbowax mempunyai struktur sebagai berikut :

Gugus yang dapat terpolarisasi

Kerangka non polar yang

Dinamakan Juga :

OV- 17


R R Ι Ι H O - CH - CH2 -(0- CH - CH2)n- OH Jenis Carbowax tergantung pada harga dari n (= derajad polimerisasi)

dan gugus R, misal : Carbowax 20 M. Poliester juga termasuk dalam

golongan fasa-fasa cair polar. Sering digunakan ester-ester dari asam-

asam di karboksilat alifatik atau aromatik.dan etilen glikol.

Fasa-fasa cair polar dapat mempunyai sifat baik sebagai penerima

(acceptors) maupun pemberi (donor) ikatan hidrogen. Sehingga fasa

cair tersebut dapat memisahkan campuran senyawa-senyawa polar dan

non polar dalam suatu cuplikan yaitu dengan menahan komponen-

komponen polar.

Pembagian fasa cair Berdasarkan Ikatan Hidrogen

Pengertian ikatan hidrogen : Misal R - O - H, dapat memberi, tetapi juga

dapat menerima ikatan hidrogen.

Penerima pemberi

Atom-atom penerima biasanya :O, N, F.

Atom-atom pemberi adalah H aktif

Senyawa-senyawa yang paling polar dapat menerima dan memberi

ikatan-ikatan hidrogen. Sedangkan senyawa organik yang kurang polar

(= non polar) tidak dapat menerima maupun memberi ikatan hidrotren.

Dengan cara ini kita akan membagi/mengklasifikasikan solute sebagai

berikut :

Klas 1 (sangat polar) Klas 2 (Polar) Scnyawa-senyawa yang sangat polar, dapat

Solute mengandung baik atom penerima dan atom H aktif


membentuk ikatan hydrogen

- air -alkohol-alkohol - glikol, gliserol, dsb -asam-asam lemak - amino alkohol -fenol-fenol - asam-asam hidroksi -amino primer dan sekunder -poli penol -oksim -Asam-asam di basa -senyawa-senyawa nitro dengan atom-

atom H – a -nitrit-nitrit dengan atom-atom H-a -NH3, HF NZH4, HCN Klas 3 (Polaritas medium) Seyawa-senyawa ini hat?ya mengandung atom-atom penerima tetapi atom H aktif.

Klas 4 (Polaritas rendah) Senyawa-senyawa ini hanya mengan-dung atom H aktif, tidak memiliki atom penerima.

- eter - keton - aldehida - amina tersier -senyawa-senyawa nitro yang lain. - nitrit-nitrit yang lain

- CHCL3, CH2, CL2 - CH3 CHCL2, CH2CI CH2CI - CH2CI CH2CI2, dsb. - hidrokarbon aromatik - hidrokarbon olefin

Klas 5 (non Polar) Senyawa-senyawa ini tidak dapat membentuk ikatan hidrogen

- hidrokarbon-hidrokarbon jenuh - CS2 - merkaptan -senyawa-senyawa halokarbonyang lain (CCl4)

Fasa-fasa cair juga dikelompokkan/dibagi menjadi beberapa klas, dalam hai

ini menjadi 4 klas, jika didasarkan atas polaritas; akan membentuk ikatan -

ikatan hidrogen. Pada umumnya urutan berikut untuk menyatakan ikatan H

yang diterima menurun :

O R R-O-R R-C RC C = O R-CN R-NO2 O R R

Klas A (Untuk klas 1) Klas B (Untuk klas 2)


FFAP

20M-TPA

Veons

Versamid 900

Hall comid

Quadrol

Theed

Mannitol

Castorwax

Digliseroi

Tetrasianoetil penta hidtrol

Zonyl E-7

Ethofat

β.β oksidipropiontil

XE - 60

XF - 1150

Sianoetil sukrosa

Amine 220

Epon 1001

Sioneotil sukrosa

Klas C (Untuk klas 3) Klas D (Untuk klas 4, 5)

semua polyester

Dimetil sulfolan

Dibutil tetra kloroftolat

SAIB

Trieresil fosfat

STAP

Densil sianida

H exan

Propiler Karbonat

Q F-1

Poligenil eter

OV-17

SE - 30

SF - 96

DC - 200

DOQ - 11

Squalane

Hexadecane

Apikson

V-1

Berikut adalah tabel "campuran" klas yang perlu diketahui. tabel inipun

didasarkan pada "like dissolves like" :

Interaksi fasa cair-solute Pengaruh pada retensi

3 -- C 4 - D 5 – C

Sistem ideal : solut terpisah sesuai dengan titik didih

4-C Solute ditahan dengan baik oleh dasa cair.Fasa fasa Cair spesifik

1,2,3- A,B (dalam semua gabungan)

Biasanya solute ditahan oleh fasa cair

2-D 4,5-A

Solute tidak ditahan oleh fasa cair : Kelarutannya sangat kecil

Ada tiga contoh yang akan dikemukakan di sini :

1). Kompleksperaknitrat


Ion-ion perak membentuk hasil addisi yang dapat balik dengan olefin -

olefin. Hingga dengan demikian senyawa-senyawa olefin dalam cuplikan

dapat ditahan secara selektif.

2). Padatan pendukung dari kolom GLC dapat ditambah den-Ran KOH.

Dengan cara ini penyerapan dapat terjadi. Misal, pemisahan terhadap O,

M dan p toluidin.

CH3 I

3). Fasa diam yang sedang dikembangkan adalah : Durapak.

Di sini padatan pendukung terikat secara kimia pada fasa cair. Struktur

dari Durapak adalah sebagai berikut :

Biasanya solute ditahan oleh fasa cair.

Solute tidak ditahan oleh fasa cair : Kelarutannya sangat kecil

Dalam hal ini "Colum-bleeding" tidak mungkin terjadi.

b. Suhu Tempat Injeksi

Ada tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam

kromatografi gas/GLC/GC, yaitu :

a). Suhu Tempat Injeksi

Yang disimpulkan sebagai berikut :

1. Harus cukup tinggi untuk menguapkan cuplikan.

padatan pendukung

ukuran 80/100 mesh


2. iasanya = 50°C lebih tinggi daripada titik didih dari komponen dari cuplikan.

Harus dicoba hingga diperoleh bentuk puncak yang paling baik.

3. Tidak terlalu tinggi, sebab kalau terlalu tinggi akibatnya kemungkinan

terjadinya perubahan oleh panas atau peruraian dari molekul-molekul.

b). Suhu kolom

1. Dalam semua hal di atas titik lebur dari fasa cair, tetapi di bawah suhu

maksimum yang diperbolehkan dari fasa cair.

2. Dalam praktek suhu kolom berdasarkan atas kompromi, Suhu-suhu yang

rendah memberikan pemisahan lebih baik, ictapi waktu retcnsi Iebih

panjang. Kompromi : kira-kira sama dengan rata-rata dari titik didih dari

cuplikan.

3. Waktu retensi mcnjadi lipat dua untuk sctiap 30°C penurunan suhu kolom.

c). Suhu detektor

Cukup tinggi untuk mencegah kondensasi dari cuplikan. Keadaan ini dapat

dilihat pada kromatogram dengan adanya pelebaran puncak atau hilangnya

puncak.

- Dengan TCD, suhu detektor harus tetap dijaga, tetap : ± 0,1 °C.

- Untuk FID pengontrolan suhu tidak begitu penting.

Suhu yang diprogram

Suhu kolom dalam GLC dapat dibuat tetap atau dapat divariasi/diprogram.

Yang terakhir disebut kromatografi gas dengan suhu yang diprogram

(Programmed Temperature Gas Chromatography = PTGC).

Pada pemisahan-pemisahan dengan GLC dengan suhu yang tetap

(isothermal), hanya dapat memisahkan komponen-komponen dari cuplikan

dengan perbedaan titik didih maksimum kira-kira 100°C. Akibatnya waktu-

waktu retensi sangat tinggi untuk komponen-komponen yang memiliki titik didih

yang paling tinggi. Lebih lanjut bentuk puncak yang diperoleh menjadi jelek.


Pada kromatografi gas dengan suhu yang diprogram kita dapat bekerja mula-

mula dengan suhu kolom rendah dan kemudian secara otomatis suhu

dinaikkan. Bila digambarkan mempunyai bentuk seperti :

Catatan :

Suatu campuran dengan titik didih tinggi akan membeku dalam kolom pada

suhu permulaan yang rendah, sehingga tidak boleh

memasukkan/menginjeksikan cuplikan. Alternatif rnengubah senyawa

tersebut menjadi turunannya yang mempunyai titik didih yang rendah.

2. LEMBAR KERJA

3. EVALUASI

1. Jelaskan hal-hal apa saja yang dapat menyebabkan pada kromatogram gas

normal, tidak ada puncak-puncak kecil, tetapi berupa bentuk-bentuk kurva,

yang disebut kurva-kurva Gauss, (pelebaran puncak), atau bila keadaannya

lebih jelek akan menghasilkan puncak-puncak berekor atau pemanjangan di

muka!

2. Jelaskan apa yang dimaksud dengan "like, dissolves like" pada GLC!

3. Jelaskan 4 kondisi untuk GLC linier yang ideal!

4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan effisiensi kolom yang diukur

sebagai jumlah pelat teoritis : N. atau "The height equivalent to a

theoretical plate, the HETP" (ketinggian ekuivalen terhadap pelat

teoritis)!


5. Polaritas dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk

memperoleh pemisahan GLC yang baik, jelaskan pembagian fasa diam

tersebut berdasarkan tingkat kepolaran!

6. Sebutkan 3 jenis fasa cair non polar yang anda ketahui!

7. jelaskan pembagian fasa cair berdasarkan Ikatan Hidrogen!

8. Sebutkan tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam

kromatografi gas/GLC/GC!


DAFTAR PUSTAKA

1. McNair & E.J.Bonelli, 1988, Dasar Kromatografi Gas, Penerbit ITB Bandung

2. Skoog, Doughlas, A and James J Leary, 1992, Principles of Instrumental

Analysis, Saunders College Publishing, New York.

3. Mulya Suryadarma, dkk. 2004, Pengembangan Metode Analisis, Airlangga

Press, Surabaya.

Date post:	12-Nov-2023
Category:	Documents
Upload:	unmul
View:	1 times
Download:	0 times

Modul Kromatografi

Documents