國 立 成 功 大 學

微 機 電 系 統 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

應用原子力顯微術於 PC12類神經細胞之生物力學研究

Application of Atomic Force Microscopy to Biomechanics of PC12 Neuron-like Cell

研 究 生 張嘉峰

指導教授 朱銘祥

林宙晴

中華民國九十五年 七月

I

摘 要

近年來隨著組織工程與神經科學的興起神經再生的研究已不再限

於理論的階段而進入了實際的應用其中的關鍵在於如何引導神經元往

正確方向再生且期待此再生程序能夠快速完成雖已發展出輔助的神

經導管以及許多促進再生的藥物但是針對神經細胞的機械特性及外在

物理性刺激對神經再生影響的研究仍在多方發展中

本研究著眼於細胞力學的領域利用原子力顯微鏡建立一套能準確

量測到細胞力學特性的實驗方法能夠估測細胞的機械特性進而評估

細胞整體力學模型傳統計算細胞表面楊氏係數由赫茲模型(Hertz model)

得到但其方法存在著一些問題本研究為了探討神經再生模型量測

的試樣為 PC12類神經細胞加入神經生長因子(nerve growth factor)使

其誘導出神經軸突首先對神經細胞本體以廣泛密集範圍的單點壓痕

量測由非赫茲方法(Non-Hertzian Approach)計算各區域的表面楊氏係數

的大小與分布變化性將結果與文獻比較以提高本實驗方法的可信度

之後對神經軸突廣泛範圍壓痕測試得到其各部份的機械特性希望其

結果能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料

實驗結果與細胞生物學理論一致所量測的細胞各區域表面楊氏係

數雖略大於文獻中的記載但亦證明此方法有效且可信後續研究將可

能提供神經細胞機械性質量測一個有效的方法

關鍵字原子力顯微鏡神經細胞Non-Hertzian approach表面楊氏係

數

II

1 Abstract

In recent years the fast progress of tissue engineering and neuro-science

enhances the research of nerve regeneration In the research of nerve

regeneration process morphological change and biochemical reaction had

been investigated widely but the mechanical properties and effects of

physical stimulations to growth of neural cells remains unclear

In this study an atomic force microscopy was employed to develop

accurate technique for measuring the mechanical properties of living cells and

to build the mechanical model of the whole cell

The existing method of analyzing AFM indentation data is based on a

simplified Hertz theory that requires unrealistic assumptions about cell

indentation experiment To investigate the regeneration of Neuron-like PC12

cells were cultivated and facilitated by nerve growth factor to induce axon

Single-point indentations on large and small region of PC12 cell body were

performed and a non-Hertzian approach was adopted to calculate the

distribution of apparent Youngrsquos modulus A large range indentation on axon

was conducted the apparent Youngrsquos modulus was calculated by the same

method A biomechanical model of PC12 cell was built Experimental results

revealed that the distribution of apparent Youngrsquos modulus is consistent with

the structure of the PC12 cell although the apparent Youngrsquos moduli were

slightly larger than the data found in the literature The non-Hertzian method

may be an effective and reliable method for estimating the mechanical

properties of the cell

Keyword Atoms force microscopePC12 cellNon-Hertzian approach

Apparent Youngrsquos modulus

III

誌 謝

於兩年的碩士研究生生涯裡非常感激指導教授 朱銘祥教授

林宙晴醫師的細心指導以及在生活中的照顧並在研究的挫折中不斷的

幫助與鼓勵本論文能順利完成有賴於張憲彰老師林仁輝老師與吳英

正老師對論文詳實的斧正和建議

於碩士的生涯中非常感謝鄭恆星學長陳志瑋學長吳振緯學長

對研究的方法以及觀念的指正還有榮健學長華禮學長品誠學長

景超學長柏凱學長敦皓學長振煒學長和宗翰學長不斷的幫忙與協

助以及同學明志威呈柏瑋大中一起打拼的互相激勵並感謝學

弟大雄小黑阿祥小馬的幫忙

在實驗相關感謝曾淑芬老師提供細胞培養的方法以及文玲學姊

指導加上助理佩姿俞慧和裕閔的幫忙另外感謝張憲彰老師實驗室

佩瑜學姊及楊凱協助使本實驗能得以完成並感謝微機電所辦玉凌姐

怡君姐在課務方面幫忙在此特別謝謝他們

最後感謝父母的栽培以及家人們在背後的默默的支持讓我得以

完成碩士的學業而沒有後顧之憂

IV

目 錄

摘 要 I

Abstract II

目 錄 IV

圖目錄 VII

表目錄 X

符號表 XI

1 第一章 緒 論 1

1-1 研究背景1

1-2 文獻回顧5

1-3研究動機與目的8

1-4本文架構9

2 第二章 方法與實驗 10

2-1 原子力顯微鏡介紹10

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論10

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理11

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式12

2-1-3-1 量測模式 12

2-1-3-2 成像模式 14

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備15

2-1-5 軟體介面 17

2-1-6 原子力顯微鏡探針 19

2-1-7 懸臂樑探針校正 20

2-1-8 校正結果 22

V

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序24

2-2-1 細胞培養方法 24

2-2-2神經軸突誘出程序25

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach28

2-3-1 Sneddon model28

2-3-2 Non-Hertzian approach 30

2-4 神經細胞力學實驗33

2-4-1實驗方式 34

2-4-2神經細胞本體定位量測34

2-4-3 神經軸突定位量測 35

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve) 35

2-4-5 細胞力學特性量測 37

3 第三章 結 果 40

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果40

3-1-1細胞區域定義 40

3-1-2 與現有文獻結果比較48

3-2 PC12 神經細胞軸突廣泛範圍量測結果49

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果49

3-2-2 Sneddon model結果 51

3-2-3 Non-Hertzian approach結果 54

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果55

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義55

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果56

4 第四章 討 論 62

4-1 與先前量測方法比較62

VI

4-1-1 先前量測方法介紹 62

4-1-2 方法比較與討論 63

4-2 AFM量測過程的成像誤差 65

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法65

4-2-2 細胞高度修正 66

4-3 神經細胞力學模型68

4-3-1神經細胞構造理論 68

4-3-2廣泛範圍量測結果 69

4-3-3細胞密集區域量測討論70

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響70

4-3-3-2 表面楊氏係數分布70

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數71

4-4-1 淺凹陷深度討論 72

4-4-2 深凹陷深度討論 73

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較77

5 第五章 結論與建議 78

5-1結論78

5-2 建議79

6 參考文獻 80

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

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表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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I

摘 要

近年來隨著組織工程與神經科學的興起神經再生的研究已不再限

於理論的階段而進入了實際的應用其中的關鍵在於如何引導神經元往

正確方向再生且期待此再生程序能夠快速完成雖已發展出輔助的神

經導管以及許多促進再生的藥物但是針對神經細胞的機械特性及外在

物理性刺激對神經再生影響的研究仍在多方發展中

本研究著眼於細胞力學的領域利用原子力顯微鏡建立一套能準確

量測到細胞力學特性的實驗方法能夠估測細胞的機械特性進而評估

細胞整體力學模型傳統計算細胞表面楊氏係數由赫茲模型(Hertz model)

得到但其方法存在著一些問題本研究為了探討神經再生模型量測

的試樣為 PC12類神經細胞加入神經生長因子(nerve growth factor)使

其誘導出神經軸突首先對神經細胞本體以廣泛密集範圍的單點壓痕

量測由非赫茲方法(Non-Hertzian Approach)計算各區域的表面楊氏係數

的大小與分布變化性將結果與文獻比較以提高本實驗方法的可信度

之後對神經軸突廣泛範圍壓痕測試得到其各部份的機械特性希望其

結果能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料

實驗結果與細胞生物學理論一致所量測的細胞各區域表面楊氏係

數雖略大於文獻中的記載但亦證明此方法有效且可信後續研究將可

能提供神經細胞機械性質量測一個有效的方法

關鍵字原子力顯微鏡神經細胞Non-Hertzian approach表面楊氏係

數

II

1 Abstract

In recent years the fast progress of tissue engineering and neuro-science

enhances the research of nerve regeneration In the research of nerve

regeneration process morphological change and biochemical reaction had

been investigated widely but the mechanical properties and effects of

physical stimulations to growth of neural cells remains unclear

In this study an atomic force microscopy was employed to develop

accurate technique for measuring the mechanical properties of living cells and

to build the mechanical model of the whole cell

The existing method of analyzing AFM indentation data is based on a

simplified Hertz theory that requires unrealistic assumptions about cell

indentation experiment To investigate the regeneration of Neuron-like PC12

cells were cultivated and facilitated by nerve growth factor to induce axon

Single-point indentations on large and small region of PC12 cell body were

performed and a non-Hertzian approach was adopted to calculate the

distribution of apparent Youngrsquos modulus A large range indentation on axon

was conducted the apparent Youngrsquos modulus was calculated by the same

method A biomechanical model of PC12 cell was built Experimental results

revealed that the distribution of apparent Youngrsquos modulus is consistent with

the structure of the PC12 cell although the apparent Youngrsquos moduli were

slightly larger than the data found in the literature The non-Hertzian method

may be an effective and reliable method for estimating the mechanical

properties of the cell

Keyword Atoms force microscopePC12 cellNon-Hertzian approach

Apparent Youngrsquos modulus

III

誌 謝

於兩年的碩士研究生生涯裡非常感激指導教授 朱銘祥教授

林宙晴醫師的細心指導以及在生活中的照顧並在研究的挫折中不斷的

幫助與鼓勵本論文能順利完成有賴於張憲彰老師林仁輝老師與吳英

正老師對論文詳實的斧正和建議

於碩士的生涯中非常感謝鄭恆星學長陳志瑋學長吳振緯學長

對研究的方法以及觀念的指正還有榮健學長華禮學長品誠學長

景超學長柏凱學長敦皓學長振煒學長和宗翰學長不斷的幫忙與協

助以及同學明志威呈柏瑋大中一起打拼的互相激勵並感謝學

弟大雄小黑阿祥小馬的幫忙

在實驗相關感謝曾淑芬老師提供細胞培養的方法以及文玲學姊

指導加上助理佩姿俞慧和裕閔的幫忙另外感謝張憲彰老師實驗室

佩瑜學姊及楊凱協助使本實驗能得以完成並感謝微機電所辦玉凌姐

怡君姐在課務方面幫忙在此特別謝謝他們

最後感謝父母的栽培以及家人們在背後的默默的支持讓我得以

完成碩士的學業而沒有後顧之憂

IV

目 錄

摘 要 I

Abstract II

目 錄 IV

圖目錄 VII

表目錄 X

符號表 XI

1 第一章 緒 論 1

1-1 研究背景1

1-2 文獻回顧5

1-3研究動機與目的8

1-4本文架構9

2 第二章 方法與實驗 10

2-1 原子力顯微鏡介紹10

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論10

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理11

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式12

2-1-3-1 量測模式 12

2-1-3-2 成像模式 14

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備15

2-1-5 軟體介面 17

2-1-6 原子力顯微鏡探針 19

2-1-7 懸臂樑探針校正 20

2-1-8 校正結果 22

V

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序24

2-2-1 細胞培養方法 24

2-2-2神經軸突誘出程序25

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach28

2-3-1 Sneddon model28

2-3-2 Non-Hertzian approach 30

2-4 神經細胞力學實驗33

2-4-1實驗方式 34

2-4-2神經細胞本體定位量測34

2-4-3 神經軸突定位量測 35

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve) 35

2-4-5 細胞力學特性量測 37

3 第三章 結 果 40

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果40

3-1-1細胞區域定義 40

3-1-2 與現有文獻結果比較48

3-2 PC12 神經細胞軸突廣泛範圍量測結果49

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果49

3-2-2 Sneddon model結果 51

3-2-3 Non-Hertzian approach結果 54

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果55

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義55

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果56

4 第四章 討 論 62

4-1 與先前量測方法比較62

VI

4-1-1 先前量測方法介紹 62

4-1-2 方法比較與討論 63

4-2 AFM量測過程的成像誤差 65

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法65

4-2-2 細胞高度修正 66

4-3 神經細胞力學模型68

4-3-1神經細胞構造理論 68

4-3-2廣泛範圍量測結果 69

4-3-3細胞密集區域量測討論70

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響70

4-3-3-2 表面楊氏係數分布70

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數71

4-4-1 淺凹陷深度討論 72

4-4-2 深凹陷深度討論 73

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較77

5 第五章 結論與建議 78

5-1結論78

5-2 建議79

6 參考文獻 80

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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II

1 Abstract

In recent years the fast progress of tissue engineering and neuro-science

enhances the research of nerve regeneration In the research of nerve

regeneration process morphological change and biochemical reaction had

been investigated widely but the mechanical properties and effects of

physical stimulations to growth of neural cells remains unclear

In this study an atomic force microscopy was employed to develop

accurate technique for measuring the mechanical properties of living cells and

to build the mechanical model of the whole cell

The existing method of analyzing AFM indentation data is based on a

simplified Hertz theory that requires unrealistic assumptions about cell

indentation experiment To investigate the regeneration of Neuron-like PC12

cells were cultivated and facilitated by nerve growth factor to induce axon

Single-point indentations on large and small region of PC12 cell body were

performed and a non-Hertzian approach was adopted to calculate the

distribution of apparent Youngrsquos modulus A large range indentation on axon

was conducted the apparent Youngrsquos modulus was calculated by the same

method A biomechanical model of PC12 cell was built Experimental results

revealed that the distribution of apparent Youngrsquos modulus is consistent with

the structure of the PC12 cell although the apparent Youngrsquos moduli were

slightly larger than the data found in the literature The non-Hertzian method

may be an effective and reliable method for estimating the mechanical

properties of the cell

Keyword Atoms force microscopePC12 cellNon-Hertzian approach

Apparent Youngrsquos modulus

III

誌 謝

於兩年的碩士研究生生涯裡非常感激指導教授 朱銘祥教授

林宙晴醫師的細心指導以及在生活中的照顧並在研究的挫折中不斷的

幫助與鼓勵本論文能順利完成有賴於張憲彰老師林仁輝老師與吳英

正老師對論文詳實的斧正和建議

於碩士的生涯中非常感謝鄭恆星學長陳志瑋學長吳振緯學長

對研究的方法以及觀念的指正還有榮健學長華禮學長品誠學長

景超學長柏凱學長敦皓學長振煒學長和宗翰學長不斷的幫忙與協

助以及同學明志威呈柏瑋大中一起打拼的互相激勵並感謝學

弟大雄小黑阿祥小馬的幫忙

在實驗相關感謝曾淑芬老師提供細胞培養的方法以及文玲學姊

指導加上助理佩姿俞慧和裕閔的幫忙另外感謝張憲彰老師實驗室

佩瑜學姊及楊凱協助使本實驗能得以完成並感謝微機電所辦玉凌姐

怡君姐在課務方面幫忙在此特別謝謝他們

最後感謝父母的栽培以及家人們在背後的默默的支持讓我得以

完成碩士的學業而沒有後顧之憂

IV

目 錄

摘 要 I

Abstract II

目 錄 IV

圖目錄 VII

表目錄 X

符號表 XI

1 第一章 緒 論 1

1-1 研究背景1

1-2 文獻回顧5

1-3研究動機與目的8

1-4本文架構9

2 第二章 方法與實驗 10

2-1 原子力顯微鏡介紹10

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論10

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理11

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式12

2-1-3-1 量測模式 12

2-1-3-2 成像模式 14

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備15

2-1-5 軟體介面 17

2-1-6 原子力顯微鏡探針 19

2-1-7 懸臂樑探針校正 20

2-1-8 校正結果 22

V

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序24

2-2-1 細胞培養方法 24

2-2-2神經軸突誘出程序25

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach28

2-3-1 Sneddon model28

2-3-2 Non-Hertzian approach 30

2-4 神經細胞力學實驗33

2-4-1實驗方式 34

2-4-2神經細胞本體定位量測34

2-4-3 神經軸突定位量測 35

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve) 35

2-4-5 細胞力學特性量測 37

3 第三章 結 果 40

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果40

3-1-1細胞區域定義 40

3-1-2 與現有文獻結果比較48

3-2 PC12 神經細胞軸突廣泛範圍量測結果49

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果49

3-2-2 Sneddon model結果 51

3-2-3 Non-Hertzian approach結果 54

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果55

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義55

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果56

4 第四章 討 論 62

4-1 與先前量測方法比較62

VI

4-1-1 先前量測方法介紹 62

4-1-2 方法比較與討論 63

4-2 AFM量測過程的成像誤差 65

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法65

4-2-2 細胞高度修正 66

4-3 神經細胞力學模型68

4-3-1神經細胞構造理論 68

4-3-2廣泛範圍量測結果 69

4-3-3細胞密集區域量測討論70

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響70

4-3-3-2 表面楊氏係數分布70

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數71

4-4-1 淺凹陷深度討論 72

4-4-2 深凹陷深度討論 73

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較77

5 第五章 結論與建議 78

5-1結論78

5-2 建議79

6 參考文獻 80

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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III

誌 謝

於兩年的碩士研究生生涯裡非常感激指導教授 朱銘祥教授

林宙晴醫師的細心指導以及在生活中的照顧並在研究的挫折中不斷的

幫助與鼓勵本論文能順利完成有賴於張憲彰老師林仁輝老師與吳英

正老師對論文詳實的斧正和建議

於碩士的生涯中非常感謝鄭恆星學長陳志瑋學長吳振緯學長

對研究的方法以及觀念的指正還有榮健學長華禮學長品誠學長

景超學長柏凱學長敦皓學長振煒學長和宗翰學長不斷的幫忙與協

助以及同學明志威呈柏瑋大中一起打拼的互相激勵並感謝學

弟大雄小黑阿祥小馬的幫忙

在實驗相關感謝曾淑芬老師提供細胞培養的方法以及文玲學姊

指導加上助理佩姿俞慧和裕閔的幫忙另外感謝張憲彰老師實驗室

佩瑜學姊及楊凱協助使本實驗能得以完成並感謝微機電所辦玉凌姐

怡君姐在課務方面幫忙在此特別謝謝他們

最後感謝父母的栽培以及家人們在背後的默默的支持讓我得以

完成碩士的學業而沒有後顧之憂

IV

目 錄

摘 要 I

Abstract II

目 錄 IV

圖目錄 VII

表目錄 X

符號表 XI

1 第一章 緒 論 1

1-1 研究背景1

1-2 文獻回顧5

1-3研究動機與目的8

1-4本文架構9

2 第二章 方法與實驗 10

2-1 原子力顯微鏡介紹10

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論10

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理11

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式12

2-1-3-1 量測模式 12

2-1-3-2 成像模式 14

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備15

2-1-5 軟體介面 17

2-1-6 原子力顯微鏡探針 19

2-1-7 懸臂樑探針校正 20

2-1-8 校正結果 22

V

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序24

2-2-1 細胞培養方法 24

2-2-2神經軸突誘出程序25

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach28

2-3-1 Sneddon model28

2-3-2 Non-Hertzian approach 30

2-4 神經細胞力學實驗33

2-4-1實驗方式 34

2-4-2神經細胞本體定位量測34

2-4-3 神經軸突定位量測 35

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve) 35

2-4-5 細胞力學特性量測 37

3 第三章 結 果 40

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果40

3-1-1細胞區域定義 40

3-1-2 與現有文獻結果比較48

3-2 PC12 神經細胞軸突廣泛範圍量測結果49

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果49

3-2-2 Sneddon model結果 51

3-2-3 Non-Hertzian approach結果 54

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果55

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義55

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果56

4 第四章 討 論 62

4-1 與先前量測方法比較62

VI

4-1-1 先前量測方法介紹 62

4-1-2 方法比較與討論 63

4-2 AFM量測過程的成像誤差 65

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法65

4-2-2 細胞高度修正 66

4-3 神經細胞力學模型68

4-3-1神經細胞構造理論 68

4-3-2廣泛範圍量測結果 69

4-3-3細胞密集區域量測討論70

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響70

4-3-3-2 表面楊氏係數分布70

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數71

4-4-1 淺凹陷深度討論 72

4-4-2 深凹陷深度討論 73

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較77

5 第五章 結論與建議 78

5-1結論78

5-2 建議79

6 參考文獻 80

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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IV

目 錄

摘 要 I

Abstract II

目 錄 IV

圖目錄 VII

表目錄 X

符號表 XI

1 第一章 緒 論 1

1-1 研究背景1

1-2 文獻回顧5

1-3研究動機與目的8

1-4本文架構9

2 第二章 方法與實驗 10

2-1 原子力顯微鏡介紹10

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論10

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理11

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式12

2-1-3-1 量測模式 12

2-1-3-2 成像模式 14

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備15

2-1-5 軟體介面 17

2-1-6 原子力顯微鏡探針 19

2-1-7 懸臂樑探針校正 20

2-1-8 校正結果 22

V

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序24

2-2-1 細胞培養方法 24

2-2-2神經軸突誘出程序25

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach28

2-3-1 Sneddon model28

2-3-2 Non-Hertzian approach 30

2-4 神經細胞力學實驗33

2-4-1實驗方式 34

2-4-2神經細胞本體定位量測34

2-4-3 神經軸突定位量測 35

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve) 35

2-4-5 細胞力學特性量測 37

3 第三章 結 果 40

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果40

3-1-1細胞區域定義 40

3-1-2 與現有文獻結果比較48

3-2 PC12 神經細胞軸突廣泛範圍量測結果49

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果49

3-2-2 Sneddon model結果 51

3-2-3 Non-Hertzian approach結果 54

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果55

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義55

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果56

4 第四章 討 論 62

4-1 與先前量測方法比較62

VI

4-1-1 先前量測方法介紹 62

4-1-2 方法比較與討論 63

4-2 AFM量測過程的成像誤差 65

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法65

4-2-2 細胞高度修正 66

4-3 神經細胞力學模型68

4-3-1神經細胞構造理論 68

4-3-2廣泛範圍量測結果 69

4-3-3細胞密集區域量測討論70

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響70

4-3-3-2 表面楊氏係數分布70

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數71

4-4-1 淺凹陷深度討論 72

4-4-2 深凹陷深度討論 73

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較77

5 第五章 結論與建議 78

5-1結論78

5-2 建議79

6 參考文獻 80

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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V

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序24

2-2-1 細胞培養方法 24

2-2-2神經軸突誘出程序25

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach28

2-3-1 Sneddon model28

2-3-2 Non-Hertzian approach 30

2-4 神經細胞力學實驗33

2-4-1實驗方式 34

2-4-2神經細胞本體定位量測34

2-4-3 神經軸突定位量測 35

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve) 35

2-4-5 細胞力學特性量測 37

3 第三章 結 果 40

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果40

3-1-1細胞區域定義 40

3-1-2 與現有文獻結果比較48

3-2 PC12 神經細胞軸突廣泛範圍量測結果49

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果49

3-2-2 Sneddon model結果 51

3-2-3 Non-Hertzian approach結果 54

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果55

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義55

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果56

4 第四章 討 論 62

4-1 與先前量測方法比較62

VI

4-1-1 先前量測方法介紹 62

4-1-2 方法比較與討論 63

4-2 AFM量測過程的成像誤差 65

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法65

4-2-2 細胞高度修正 66

4-3 神經細胞力學模型68

4-3-1神經細胞構造理論 68

4-3-2廣泛範圍量測結果 69

4-3-3細胞密集區域量測討論70

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響70

4-3-3-2 表面楊氏係數分布70

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數71

4-4-1 淺凹陷深度討論 72

4-4-2 深凹陷深度討論 73

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較77

5 第五章 結論與建議 78

5-1結論78

5-2 建議79

6 參考文獻 80

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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VI

4-1-1 先前量測方法介紹 62

4-1-2 方法比較與討論 63

4-2 AFM量測過程的成像誤差 65

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法65

4-2-2 細胞高度修正 66

4-3 神經細胞力學模型68

4-3-1神經細胞構造理論 68

4-3-2廣泛範圍量測結果 69

4-3-3細胞密集區域量測討論70

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響70

4-3-3-2 表面楊氏係數分布70

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數71

4-4-1 淺凹陷深度討論 72

4-4-2 深凹陷深度討論 73

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較77

5 第五章 結論與建議 78

5-1結論78

5-2 建議79

6 參考文獻 80

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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ldquoDefined adhesion and growth of neurones on artificial structured

substratesrdquo Electrochimica Acta vol 47 pp 299ndash307 2001

VII

圖目錄

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖 3

圖 1-2 神經元的形態與連結4

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖11

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統12

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式13

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式14

圖 2-5原子力顯微鏡系統15

圖 2-6 原子力顯微鏡本體15

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖16

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造16

圖 2-9 光電感測器訊號圖17

圖 2-10 軟體介面圖17

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint） 18

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖19

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀19

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖 21

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率 22

圖 2-16 尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖 29

圖 2-17 探針形狀30

圖 2-18 鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖 31

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構33

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖34

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測 35

VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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VIII

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係 36

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖37

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線 38

圖 3-1 細胞高度圖40

圖 3-2 細胞區域劃分圖41

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較 41

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較42

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果 43

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果 44

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果 45

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖46

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積47

圖 3-10軸突各區域量測結果49

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線 50

圖 3-12軸突各區域壓痕力量50

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果 51

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果 52

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果 53

圖 3-16 細胞小區域示意圖55

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布 58

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖58

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖59

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖59

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖60

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖60

IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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IX

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖61

圖 4-1 先前方法量測示意圖62

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish) 63

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖 65

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖67

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖68

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖69

圖 4-7推測神經細胞力學模型71

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖 73

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖74

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

76

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖76

X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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X

表目錄

表 2-1探針尺寸與機械性質20

表 2-2 探針校正結果23

表 2-3細胞實驗所需儀器26

表 2-4細胞實驗所需藥品27

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係47

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果48

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果54

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較 54

表 3-5細胞小區域量測結果56

表 4-1方法比較64

表 4-2 細胞高度修正結果67

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表 75

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表75

XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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XI

符號表

a 接觸半徑

b 過渡半徑

d 探針偏折量

0d 初始探針偏折量

aE 表面楊氏係數

E 探針彈性係數

E~ 廣義彈性係數

~E 最佳廣義彈性係數

F 壓痕力量

ck 懸臂樑彈性係數

R 尖端圓錐半徑

Z 探針垂直下壓量

0Z 初始探針垂直下壓量

δ 凹陷深度

( )δφ 凹陷面積

α 探針尖端半錐角

1α 探針半角

ν 蒲松比

θ 懸臂樑探針夾角

1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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1

1 第一章 緒 論

1-1 研究背景

近年來國外力學研究趨勢已經從純物理系統力學研究轉向細胞及分

子的力學現象加上近年掃描探針顯微鏡的發明及改進大大擴充人類

的視野從宏觀引入到微觀對於肉眼所看不見的世界有能力去探討隨

著醫學工程的進步有越來越多的手術將生物材料植入到人體中如全人

工關節置換人工植牙等在這些手術中體內的細胞能否有與植入材料

相容性問題恢復到之前組織或器官所具有相同功能這些便成為影響

手術成功的關鍵目前組織或器官的替代方式大多以人工機械裝置與活

體移植但是所面對的問題還是很多如生物相容性使用年限器官

捐贈不足hellip等等假設人類若能代替上帝而是自己『養組織養器官』

如同人體上實實在在的組織不是由金屬所構成的裝置作機械式運轉

因此不會有移植物與原本組織不相容的困擾這就是組織工程（tissue

engineering）新境界的夢想

組織工程的定義應用生物與工程的原理發展活組織的取代物來修

復維持或改善人體組織的功能而此取代物將成為病人身體的一部分

也就是移植具有正常或類似功能的人工組織或器官於損傷處以期能夠

達到修復的目的現在組織工程的基本做法是先由人體取出細胞在

體外將細胞培養到足夠的數量然後將這些細胞填入養在人工支架裡

適當添加化學藥物或生長因子促進細胞的分化最後將此人工組織移植

到患者身上上述基本做法中可以知道組織工程有三大要素細胞

（cell）支撐細胞生長所需的細胞內骨架(cytoskeleton)影響細胞行為的

訊息因子（signal factor）[1]所以在組織成形（tissue morphogenesis）當

中牽涉了細胞與細胞外基質(extracellular matrix ECM）間之作用這些作

2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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2

用也同時受到溶解於組織液中的無數的生長因子荷爾蒙細胞激素等

調控而之間互相牽引作用與力學特性有關從許多生物學家討論在組

織發育過程當中基因啟動或關閉而影響細胞的繁殖與分化就這些單單

靠生物和化學的研究闡明胚胎能在適當的時間生長分化仍有很多問題

需要釐清過去 20年越來越多工程領域學者深信細胞與基質之間的牽引

力必定在胚胎發育的組織形成時佔有不為人所知的角色某些力學特性

的表現會決定組織的成型這就是組織工程的發展需要細胞力學的研

究來說明這些力學對細胞分化與移動的影響

當細胞在接觸基質時發生貼附（attachment）及黏著（adhesion）的現

象這時調控細胞貼附和細胞骨架的在細胞力學扮演重要的角色細胞

主要是透過受器(integrin）將細胞骨架與細胞外基質聯結在一起[2]且細

胞外基質上的蛋白質接受器透過細胞質中的蛋白質複合體與肌動蛋白細

絲(actin filament)形成動態的聯結在這個組合過程細胞內的蛋白質聚集

並形成一緻密包裝的複合體不僅調整類似應力纖維(stress fiber)肌動蛋

白細絲束的形成也參與了細胞訊息的傳遞如圖 1-1所示[3]這些結

構蛋白的組合影響細胞在基質上的繁殖（ proliferation）分化

（differentiation）移動（migration）及凋亡（apoptosis）進而影響細

胞的生長行為[4]

細胞外基質包含許許多多不同的分子其中最重要為膠原蛋白

（collagen）纖維各組織之間或同組織的不同區域所含之膠原蛋白型式

會有不同這些細胞外基質及纖維基本上就是支架支撐著組織的形狀

胚胎發育初期只是一團細胞而已經過一段時間細胞才開始製造分泌細

胞外基質（初期只是膠原白）若此時膠原蛋白的合成受到抑制胚胎的發

育就會停頓可見這些細胞外基質對於細胞的分裂及組織的形成具有絕

對重要的角色

3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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3

圖 1-1 細胞貼附細胞外基質應力纖維分佈關係示意圖

細胞力學的研究對於組織工程有很大的重要性對於細胞貼附

(adhesion)細胞骨架的組織 (cytoskeletal organization)細胞能動性

(motility)細胞遷移(migration)甚至是組織或器官的表面型態若能利

用組織工程理論配合微奈米量測儀器(如原子力顯微鏡奈米壓痕測試儀)

得知細胞力學特性來觀察正常細胞與病變細胞的差異性及細胞生長與分

裂的力學機制可幫助預測或控制細胞在不同環境下或人造材料上其行

為的差異並且透過以細胞為基礎的技術應用在生物感測器醫學植入

物組織工程人造神經網路生物電腦等此外透過細胞力學研究也

可以在預防醫學上有所幫助而達到事先預知事先預防的效果

目前意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害與病變的發生

率亦愈趨嚴重傳統上神經損傷的診斷只能靠電生理檢查來判定尚

缺乏活體組織結構的診斷工具而在以現今的治療技術雖然可以藉由

顯微手術接回斷裂的神經但神經生長速度緩慢且效果不佳且對於僅

受損傷而未斷裂的神經仍無有效的治療方式若配合組織工程概念加上

細胞力學的研究神經再生會是一個可行性極高的研究方向

4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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4

神經系統包含中樞神經系統(central nervous system)以及周邊神經系

統(peripheral nervous system)中樞神經包含腦與脊髓周邊神經包含成

對的腦神經和脊髓神經神經細胞的形態一般可區分為三部分細胞體

(soma)軸突(axon)樹突(dendrite)（如圖 1-2[5]）軸突負責送出細胞

體的訊號而樹突是接受訊號的部位而在軸突與樹突之間形成聯結的

特殊構造－突觸(synapse)則是傳遞訊號的部位

圖 1-2 神經元的形態與連結

PC12細胞為1976年Greene與Tischler[6]由一個大白鼠腎上腺髓質嗜

鉻細胞瘤(rat adrenal pheochromocytoma)選殖出的單株細胞株命名為

PC12 細胞株此細胞株與交感神經細胞(sympathetic neuron)同源當加

入 NGF 於PC12 細胞一天後會造成 PC12細胞停止增生且開始分化

分枝像靜脈曲張般地伸展延伸於分枝的中末端上累積許多小液泡

(vesicles)能合成並且儲存兒茶酚胺(catecholamine) 這類的神經傳導介質

(neurotransmitter)多巴胺 (dopamine)正腎上腺素(norepinephrine)因

此PC12 細胞就神經科學領域而言是一個很好的實驗材料可作為神經生

理神經化學神經細胞之分化或增生及存活等等不同的研究模式

5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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5

1-2 文獻回顧

近半個世紀以來隨著奈米科技的進步細胞力學的研究漸受重視

許多針對於細胞生物力學模型的研究的實驗工具一一問世例如微粒循

跡(particle tracking)微吸管(micropipette)光學鑷子(optical tweezers)

原子力顯微鏡(AFM)等等

1950年Crick和Hughes[7]利用具有磁性的微粒來量化細胞的機械特

性1954年Mitchison和Swann[8]首先發展用微吸管方式來量測海膽細

胞之後1964年Band[9]利用這方法來量測紅血球細胞膜的機械特性1980

年Ashkin等人利用光壓操作微小粒子的概念來量測細胞的黏著力以平

行的雷射光束經過顯微物鏡聚焦之後光子在穿透圓粒子的過程中因

折射而產生動量變化[10]次年Harris 等人再提出纖維母細胞與基底間交

互的牽引力(traction force)與基底上膠原蛋白(collagen)的塗佈方式有關

並提出細胞外間質(ECM)是影響牽引力的主要因素[11]近幾年量測細胞

實驗技術慢慢發展為戳壓(cell poker)與微粒循跡(particle tracking)的方

式1982年Petersen等人利用微小探針直接施加作用力於局部細胞表面

研究細胞骨架對於不同壓痕速度與不同壓痕力量所回復的變化程度

[12]且發現細胞具有黏滯的現象1993 年Wang 與Donald 也利用磁珠

牽引旋轉法探討人類氣管平滑細胞的力學行為[13]他們將磁性微珠

(Fe3O4)透過細胞表面特化的接受器穩固連接在細胞表面並且透過水平

磁場誘發使磁珠產生旋轉而依據不同細胞性質磁珠旋轉或位移量也

會不同1997年Sung利用玻璃製微小吸取器直接吸取單一細胞使細胞

受到張力作用量測細胞機械性質與基質之間的黏著力量 [14]同年

Galbraith 與Sheetz等人利用微機電製程(MEMS)製作一個多晶矽的懸臂

樑結構(cantilever beam)來量測纖維母細胞局部的牽曳力分布[15]1999

年Martin等人將細胞置於特定溫度環境下(37plusmn 01)偵測試樣在力量或

6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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6

頻率改變下細胞對於正弦或其他週期應力的頻率響應以由模數及相角

(phase angle)來描述其力學行為的變化進而判定細胞的黏彈特性[16]

2002年Hoben等人利用微小懸桿為施力設備使細胞受剪力作用來量測細

和基質間的黏著力量[17]2005年Emiel等人利用提供動態裝置的平台

直接施與細胞作用力來量測黏彈性性質[18]

近10年來研究細胞力學特性的利器莫過於掃描探針顯微鏡它具有

比傳統掃描電子顯微鏡更高的分辨率其放大倍數高達 810 並且可以在

生理條件下進行即時觀察並透過Hertz在1896年所提出了兩物體接觸的

彈性力學模型[19]可量測細胞的彈性係數但是該模型僅適用於兩彈性

體接觸但當量測細胞時是以堅硬的探針施壓於軟性細胞用此方法來

推算細胞的楊式係數似乎還有很多討論的空間如探針幾何形狀施於

細胞力量細胞凹陷深度等等1965年Sneddon更進一步修正赫茲模型研

究數學模型討論不同幾何形狀剛體施加負載於彈性平板得到其剛體幾

何形狀接觸面積負載力量與凹陷深度的關係[20]進而推算細胞的表

面彈性係數1994年Briscoe等人提出不同幾何形狀探針施於壓痕與不同

壓痕力量對於彈性體的凹陷深度的影響[21]1996年Radmacher等人應用

上述理論利用尖錐形探針施於血小板等向壓痕探討血小板的變形與尖

錐形探針之間的關係[22]1997年將量測試樣改為細胞利用探針與細胞

之間力量與距離的關係配合赫茲模型求出符合的彈性特性[23]同年Yin

等人用原子力顯微鏡量測彈性特性的壓痕分析描述不同生命材料經由

微小應變理論計算與有限元素法模擬後對於兩種不同方法得到壓痕力

量壓痕深度和彈性模數作比較發現當材料性質為非線性時所得到

的數值有很明顯的差異[24]1999年Rotch等人把探測的範圍變大不在

只是侷限在細胞局部而量測細胞不同部位的機械性質[25]發現纖維母

細胞邊緣的硬度會比在細胞本體高在2001年Mathur等人針對血管內皮

7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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7

細胞(endothelial)與心肌細胞(cardiac muscle)的機械性質進行測量選擇不

同幾何形狀的探針來量測細胞的機械特性並與先前研究成果加以比較

和探討[26]2005年本實驗室李宗翰研究3T3纖維母細胞對於不同的軟性

貼附基質與機械外力影響下所量測得到的外觀形貌與機械特性有所不

同[27]2006年Yin等提出一個 Non-Hertzian Approach來分析內皮細胞局

部的機械特性[28]延伸其發展之模擬的方法[24]以計算內皮細胞的機械

性質

本研究遠程目標是研究神經力學特性先前研究由巨觀的角度引

用 Fung於 1972年提出之類線性黏彈（Quasi-Linear Viscoelasticity QLV）

理論用以分析和估測活體周邊神經的機械性質[29]本研究室范家霖與陳

榮健的研究中觀察周邊神經應力與應變的關係圖發現神經為非線性

彈性材料[30 31]針對細胞力學模型的建構1996 年 Satcher 等人利用

微奈米結構方法將貼附型細胞當作電纜網路承受一個預應力來研究細胞

骨架進而推導細胞模型[32 33]1998年 Boey等人發展出顯微光譜網

狀模型(microscopicspectrin network model)研究細胞膜的分布[34]但是兩

個方法都是預設細胞骨架為一個線性材料由於細胞微絲(microfilament)

承受機械應力的反應為非線性因此建構的模型不夠完整另一方面由

巨觀實驗發現細胞具有黏彈性行為與塑性行為等應用連體力學可以

導出細胞體模型的參數雖然連體力學法不適用於分子間力學機制但

是現階段若能量測細胞的生物力學所需要的機械訊號將有助於建構細

胞的機械數值模型由此模型可以模擬細胞在不同負荷下的應力與應變

分布進而決定細胞骨架和細胞結構對於應力的分布與傳遞之影響以

提供微米尺度或奈米尺度模型之建構

8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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8

1-3研究動機與目的

在精密的人體中神經系統扮演著重要的角色一旦神經系統因為

外傷或病變而受損便會影響病人的日常生活造成家人與社會的負

擔隨著時代進步意外傷害與糖尿病等文明病例不斷增加神經傷害

與病變的發生率亦愈趨嚴重神經損傷後如果沒有經過適當的處理很

容易產生神經瘤使得受損神經無法恢復功能近年來為了避免神經瘤

的發生及協助受損神經的再生已發展出不同的神經修補及再生技術

以現今的技術雖然可以神經導管來誘導和支持神經纖維的生長使斷裂

的神經再生復原但生長緩慢且效果不佳同時對於僅受損而無斷裂的

神經並無有效的治療方式

近年來由於組織工程(tissue engineering)與神經科學(neuroscience)的

興起神經再生的研究已不再限於理論的階段而進入了實際臨床的應

用是目前相當受重視且可行性極高的研究方向然而甚多研究著重於

神經再生的方法與技術關於神經受損後再生的微觀機轉例如生長因

子(growth factor)對於神經再生的影響而或神經細胞生長過程中與周邊

結締組織間交互的力場影響都不多

所以本研究的目的為利用原子力顯微鏡來量測 PC12 神經細胞於不

同的區域以及機械特性的作用探討細胞機械性質的變化建立一套能

準確量測到神經細胞力學特性的設備藉由力學研究分析與模擬觀察

細胞生長與分裂的力學機制提供神經在導管中再生不佳現象的解釋

期待能提供建立周邊神經再生理論模型所需要的資料最終可以醫學透

過力學途徑控制神經細胞的生長與疾病

9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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9

1-4本文架構

本文總分為五章第一章為緒論簡介神經再生對現今人類的重要

性以及近 20年來研究者針對細胞生物力學的努力與成就並提出本研究

所期待達成之目標第二章為方法與實驗包含原子力顯微鏡基本理論

細胞力學理論模型兩種量測方法介紹神經細胞培養與神經軸突誘導

程序整體實驗架構第三章為實驗結果由原子力顯微鏡所得到力-距離

曲線比較神經細胞本體與神經軸突不同區域的機械性質分析曲線與推

算表面彈性係數的結果並與文獻做比較提高量測結果的可信度第四

章為討論第一節比較先前實驗方法與本實驗方法的差異說明本實驗

的改良之處第二節則是探討 AFM量測過程中成像誤差討論第三節針

對簡述細胞內部構造理論與所有實驗結果進行討論並提出神經細胞力

學模型的假說第四節是由 Sneddon model與 Non-Hertzian approach所推

算的結果討論兩方法優劣處最後第五章為結論與建議從本研究實驗

成果的優缺點加以總結並且對未來研究發展提出建議

10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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10

2 第二章 方法與實驗

本研究的目的是建立一套能準確量測細胞力學特性的實驗方法首先

將細胞培養於塗有聚左旋離氨酸(poly-L-lysine)薄膜之上透過神經生長

因子(nerve growth factor NGF)使 PC12神經細胞分化誘導出軸突藉由原

子力顯微鏡量測並計算細胞各部位與神經軸突的機械特性最後經力學

研究分析與模擬建立 PC12神經細胞與軸突的理論力學模型探討細胞

機械性質的變化

2-1 原子力顯微鏡介紹

2-1-1 原子力顯微鏡量測理論

在1985年IBM實驗室Binning和史丹福大學的Quate共同發明原子力

顯微鏡(atomic force microscope AFM)解決了原先試樣須具有導電性的

問題使人類在可探討的物質範圍跨入了原子的尺度隨後對於試樣表

面現象的研究也大增[3536]原子力顯微鏡與掃描式穿隧電流顯微鏡最

大的差別在於原子力顯微鏡沒有利用電子穿隧效應而是感測原子間之

凡得瓦爾力（Van Der Waals force）作用力的不同來呈現試樣的表面特性

當原子之間很接近時彼此電子雲斥力的作用大於原子核與電子雲之間

的吸引力作用所以整個淨力表現為斥力反之若兩原子分開有一定距

離時彼此之間電子雲斥力小於彼此原子核與電子雲之間的吸引力其

作用力與距離的關係如圖 2-1[37]這種原子與原子之間的距離與彼此之

間能量的大小也可從Lennard-Jones的公式中得到另一印證如2-1式[38]

])()[(4)( 612

rrrE σσ

ε minus= (2-1)

其中 σ為原子半徑r為兩原子間距ε為介電常數

11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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11

圖 2-1 原子之間的相互作用力示意圖

2-1-2 原子力顯微鏡量測原理

原子力顯微鏡是利用微小探針與試樣原子之間交互作用力的變化

藉由系統裡光感測器所偵測之因探針偏折造成的反射雷射光來呈現出

試樣的表面形態量測系統主要分成三個部分力量感測部分（force

sensing）位置感測部分（position sensing）回饋系統（feedback system）

如圖 2-2所示[39]以下為各部份的介紹

(1)力量感測以接觸模式為例原子力顯微鏡掃描時利用微小探針

與試樣表面接觸針尖原子和試樣表面原子產生了微弱的凡得瓦力變

化造成探針產生偏折依此偏折量可估測出探針施於待測試樣的力量

值

(2)位移感測探針產生微小撓曲時聚焦在懸臂樑背面的雷射光藉

由反射光路將懸臂樑尖端位移放大隨著試樣的表面起伏光電感測器

會接收到不同的雷射偏移量將其信號經由電腦的運算處理後即可呈現

試樣表面的三維影像

12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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12

(3)回饋系統由光電感測器擷取反射後的雷射偏移量將此訊號作

為回饋系統的輸入訊號趨動壓電掃描器做適當的移動以補償系統的

設定值避免當試樣高度變化過大時導致撞針損壞試樣的現象並可以

藉由調整回饋增益大小來決定量測模式定高或定力模式

圖 2-2 原子力顯微鏡量測系統

2-1-3 原子力顯微鏡量測模式與成像模式

原子力顯微鏡量測模式依探針與試樣間的距離可分為接觸式

（contact mode）非接觸式（non-contact mode）與半接觸式（semi-contact

mode）(如圖 2-3)而成像的模式則分為定力模式(constant force)與定高

模式(constant height)(如圖 2-4)[40]量測與成像模式並無固定標準一

般而言是依據實驗需求來選擇量測與成像模式

2-1-3-1 量測模式

（1）接觸式利用探針針尖的原子與試樣表面原子之間排斥力的變化而

產生成像探針與試樣的距離約為數埃（Aring）時兩原子之間會有互斥現

象其原子間的排斥力約為10-6~10-10 N由於探針和試樣表面之間為直接

13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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13

接觸且接觸面積極小假設試樣為軟性材質時過大的作用力可能會造

成試樣表面損壞因此在掃描生物試樣或軟性材質必須特別注意作用

力的大小是否會對試樣表面產生影響

（2）非接觸式探針針尖原子與試樣表面原子之間在長距離的情況下

感測兩原子之間因距離變化產生不同的吸引力由於探針和試樣沒有接

觸故試樣不易被損壞但最佳成像的距離也很難確定故此模式的成

像之缺點解析度較差

（3）半接觸式因接觸式與非接觸式具有上述的缺點所以發展一種介

於接觸模式與非接觸模式的方法稱做半接觸式或是敲擊模式（tapping

mode）半接觸式是改良非接觸式與接觸式的缺點其原理為探針上下

擺動並輕拍於物體表面藉由掃描器振幅的改變而成像其作用力同時

受到吸引力及排斥力的交互作用此模式優點是不受橫向力的干擾並減

少表面吸附現象適用於液相量測與試樣表面較軟的材料可以降低水

層干擾與毛細現象的產生缺點為因為探針沒有完全接觸試樣可能會

造成成像結果與實際表面形貌發生失真現象

圖 2-3 AFM之操作模式 (A)接觸式(B)非接觸式(C)半接觸式

14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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14

2-1-3-2 成像模式

（1）定力模式當試樣輪廓改變時光感測器所接收到反射雷射光的位

置會偏離基準值定力模式的原理為利用控制系統補償反射雷射光的偏

差量藉由回饋訊號驅動壓電掃瞄器做上下位移使反射雷射光回到基

準值並控制兩者之間作用力保持定值同時記錄壓電掃描器上下移動

量由此移動量繪製而成的影像圖為試樣高度圖（height）或稱地形圖

（topography）定力模式因壓電掃瞄器較大移動量故適合量測表面起

伏大的試樣如圖 2-4（A）所示

（2）定高模式在量測過程中壓電掃描器是保持在一定的高度試樣

的高低變化會使探針產生偏折透過光感測器接收到偏折量的訊號並

由此偏折量繪製而成的影像圖稱為偏折圖(deflection)或電流變化圖

(current change)因為探針偏折訊號的解析度較高可以取得試樣較細微

的結構的影像圖如圖 2-4（B）所示

圖 2-4 (A)定力模式及(B)定高模式下探針壓電掃瞄器與懸臂樑偏折量之

相對關係

15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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15

2-1-4 原子力顯微鏡硬體設備

本研究使用的原子力顯微鏡系統(圖 2-5)為 NT-MDT SPM Bio-47機

型此設備包含了(A)電腦及原廠軟體 NT-MDT NOVA(B)原子力顯微鏡

本體與(C)雷射控制主機原子力顯微鏡本體(如圖 2-6)由倒立式顯微鏡

掃瞄探頭和 CCD光學成像系統所組成

圖 2-5原子力顯微鏡系統

圖 2-6 原子力顯微鏡本體

原子力顯微鏡本體最重要的部分為掃描探頭其內包含了光感測器

( position sensitive photodetector PSPD )壓電掃描器( piezo scanner )以及

雷射光路鏡片組光電感測器是接收探針形變後偏折的雷射光由偏折

CCD光學成像系統

倒立式顯微鏡

掃描探頭( SmenB )

16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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16

量推算探針的形變量掃瞄探頭上方有雷射位置調整鈕(圖 2-7 (1)(2))

光感測器接收雷射位置(圖 2-7 (3)(4))藉由調整鈕可以設定雷射聚焦

在探針適當的位置(圖 2-8)[41]當光電感測器雷射位置改變時控制系

統能提供穩定電壓來驅動壓電驅動器使得探針垂直或平移到需要的位

置其最大掃瞄面積為 120x120 μm2 最大高度為 5~55 μm

圖 2-7 壓電掃瞄器示意圖[41]

(12為調整雷射位置34為 PSPD接收雷射位置)

圖 2-8 掃瞄探頭內部構造[41]

17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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17

2-1-5 軟體介面

將探針裝上載台放置在掃瞄探頭底部打開雷射光後調整掃描探頭

上調整鈕到適當的位置按下PSPD訊號鈕光感測器開始接收反射的雷射

光(圖 2-9[41])VER DFL代表垂直方向所接收的電流訊號LAT DFL代

表水平所接收的電流訊號LASER為所接收到的雷射量大小單位皆為

nA

圖 2-9光電感測器訊號圖

圖 2-10 軟體介面圖

圖 2-10 [41]為 AFM操作軟體介面圖FB In為回饋系統的參考輸入

訊號輸入訊號選擇的模式為 DFL代表著探針垂直方向擺動時 PSPD

上的訊號值上圖為打開迴圈開關時的設定將回饋系統開關接上時

一開始探針尖端沒有接觸到試樣表面完全不會影響雷射光反射到光感

測器垂直方向的電流訊號此時為初始電流訊號（FB In）(圖 2-11 (A))

此電流訊號值可以用掃瞄器上的調整鈕來調整垂直雷射量的高低當壓

18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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18

電掃瞄器開始靠近試樣表面探針末端受到表面的影響開始產生形變

而光電感測器所接收到垂直電流訊號會慢慢的增加當電流訊號變化達

到所設定的基準電流訊號 (SPoint) 時回饋系統會將壓電掃瞄器停止下

降而維持一定的位置使電流訊號值固定(圖 2-11(B))這時電流訊號的改

變量與探針末端的偏折量呈正比偏折量多寡代表探針施於試樣表面力

量大小(圖 2-11(B)中d 越大力量越大)開始掃瞄後探針會因細胞起

伏而產生形變光感測器所接收到反射雷射光的位置會偏離基準值而

回饋增益(FB Gain)則是影響壓電掃描器上下移動讓反射光回到基準值的

速度藉由調整此參數值決定量測模式設定太大壓電掃描器會過於靈

敏反之則遲鈍如圖 2-11(B)

Laser

Initial DFL signal

Scanner

After landing DFL signal

Scanner

ΔdLaser

FB Gain

(A) (B)

圖 2-11 (A)初始電流訊號（FB In）(B) 基準電流訊號（Spoint）

19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

[1] 李宣書 物理雙月刊（廿四卷三期）pp430-4352001 年 6 月

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19

2-1-6 原子力顯微鏡探針

本研究所使用的懸臂樑探針為 Veeco Instruments 公司所生產的

Microlever Probes此型共有五種不同幾何形狀可依照試樣的不同而使

用懸臂樑尖端會有金字塔狀的探針其結構材料為氮化矽 (silicon nitride

Si3N4)如圖 2-12(A)(B)所示[42]探針尖端的半錐角為 35度( 圖 2-13(A)

α)高度為 3 μm(圖 2-13 (A)h)厚度為 06 μm(圖 2-13 (B) t)詳細的

幾何形狀資料詳列於表 2-1

圖 2-12 (A)探針示意圖(B)懸臂樑示意圖

圖 2-13 (A)探針幾何形狀(B)懸臂樑幾何形狀

20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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20

表 2-1探針尺寸與機械性質

形 狀 長 度

(μm)

寬 度

(μm)

共振頻率

(kHz)

彈性係數

(Nm)

A Rectangular 2000 200 150 002

B Triangular 3200 220 70 001

C Triangular 2200 220 150 003

D Triangular 1400 180 380 01

E Triangular 850 180 1200 05

2-1-7 懸臂樑探針校正

原子力顯微鏡是利用一個懸臂樑探針觀察其偏折量來決定探針施於

細胞的作用力所以本身的彈性係數是為一個很重要的參數雖然廠商

都會提供懸臂樑的彈性係數供使用者推算但其值局限於探針為全新的

狀態隨著探針使用次數提高探針會漸漸失去彈性或硬化與原本的

彈性係數有所差距本章節為對使用的懸臂樑探針做彈性係數的校正

先利用 Sader 近似平行樑法則求得三角形懸臂樑探針的有效長度

(equivalent length)與有效寬度(equivalent width)(如圖 2-14)[43]

21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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21

o o

L

d

d primed

1α

oo

Lprime

d prime2

L探針長度 d探針寬度 1α 探針半角

Lprime探針有效長度 d prime2 探針有效寬度

圖 2-14 (A)實際探針幾何形狀圖(B)Sader近似平行梁示意圖

利用原子力顯微鏡在空氣中量測使用探針的共振頻率(kHz)經由

(2-2)式求出探針的彈性常數(Nm)

3

33 2 ω

ρπ

EWLk = (2-2)

其中 k為彈性係數(Nm) E為探針楊氏係數(kPa) ρ 為探針密度

(kgm3) L 為有效長度(μm) W 為有效寬度(μm)

本實驗因考慮細胞貼附性較差故使用彈性常數較小的探針型號 B

與型號 C並對這兩種型號探針做校正圖 2-15(A)(B)為兩型號在空

氣中所量測到的共振頻率探針密度為 32800 mkg 楊氏係數為

gPa130 [43]

22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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22

圖 2-15 (A)型號 B共振頻率(B) 型號 C共振頻率

2-1-8 校正結果

分別將探針型號B與型號C所得的共振頻率有效寬度有效長度代

入31式求得校正後彈性係數與廠商所提供的彈性係數值(校正前)做比

較如下表校正結果發現與廠商提供彈性係數有些差距所以探針經

多次使用後會發生彈性疲乏使原本值降低第三章所得到的表面楊氏係

數值都是由校正後彈性係數所推算

(A) (B)

23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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23

表 2-2 探針校正結果

探針型號 型號B 型號C

形狀 三角形 三角形

探針厚度(microm) 06 06

探針長度(microm) 3200 2200

探針寬度(microm) 220 220

探針有效長度(microm) 3200 2200

探針有效寬度(microm) 360 360

共振頻率(kHz) 659 1250 彈性係數(Nm)

(校正前) 001 003

彈性係數(Nm)

(校正後) 00086 0019

誤差 16 36

24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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24

2-2 神經細胞培養與神經軸突誘導程序

本研究所使用的細胞為PC12類神經細胞進行實驗前須先將細胞培

養在Poly-L-Lysine薄膜上以下為神經細胞培養流程與軸突誘導程序實

驗所需的藥品與設備詳列於表2-3表2-4

2-2-1 細胞培養方法

神經細胞培養大致上分為薄膜披覆繼代培養及軸突誘導以下為三

個程序的詳細過程

(一)薄膜前置處理(Coating Poly-L-Lysine)

將藥品及所需的器材先用酒精消毒後放入無菌操作台

將 Poly-L-Lysine用磷酸鹽緩衝液(FBS)稀釋 10倍取 03 ml的

Poly-L-Lysine加上 27 ml的滅菌水加以混合

用針筒將混合液吸起氣體推出後把針頭拔除裝上過濾器每培養

皿加入 15 ml過濾的 Poly-L-Lysine靜置 15分鐘

15分鐘後將混合液吸出用滅菌水清洗過待培養皿吹乾後便可

將其用來培養 PC12 細胞

(二)細胞繼代培養

利用顯微鏡觀察細胞密度八分滿以下只需更換培養液PC12細

胞 2-3天要更換培養液一次

當細胞密度大約超過八分滿時必須進行繼代培養將細胞分殖至

另外的培養皿繼續培養

將需要藥品取出回溫並將所使用器具用本生燈進行消毒

利用 025 胰蛋白酵素(Trypsin) 4 ml將培養皿中的細胞溶離再

25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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25

加入等量的培養基(RPMI Medium 1640 )中和之後將溶液全部抽出

置於離心管中

放入離心機後以轉速 1000 rpm進行 5分鐘離心程序此時細胞會

沉澱於管底再將溶液全部抽出

加入新鮮的培養基 12 ml後將細胞沉澱均勻抽散再注入乾淨的培

養皿中

於倒立式顯微鏡下觀察細胞狀況並計算細胞濃度

將培養皿送入 37degC 5 CO2恆定狀態培養箱中進行培養

2-2-2神經軸突誘出程序

將 NGF分裝取 10 μl的 NGF放至 15 ml的離心管將分裝好的

NGF儲存至冰箱冷凍

當要使用 NGF時再取出加入 10 ml的培養液濃度為 100 ngml

每 48小時更換一次培養液加入的容量為 3 ml

26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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26

表 2-3細胞實驗所需儀器

儀器中文名稱 儀器英文名稱 生產公司

細胞培養箱 Incubator SANYO

恆溫水浴槽 Water Bath TKS

無菌操作台 Laminar Flow Hood HIGH TEN

冰箱 Refrigerator SAMPO

吸取器 Pipette Aid ACCU-JET

桌上型離心機 Centrifuge HERMLE

高壓滅菌鍋 Autoclave TOMIN

酸鹼度計 pH Meter SARTORIUS

攪拌器 Agitator YEASTEN

電子微天平 Balances AND

本生燈 Bunsen Burner NS

震盪器 Vortex KODMAN

27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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27

表 2-4細胞實驗所需藥品

藥品中文名稱 藥品英文名稱 生產公司

培養基 RPMI Medium 1640 GIBCO

馬血清 Horse Serum( HS ) GIBCO

胎牛血清 Fetal Bovine Serum ( FBS ) GIBCO

抗生素 Penicillin-Streptomycin GIBCO

胰蛋白酵素 Trypsin GIBCO

磷酸鹽緩衝液 Phospate-Buffered Saline ( PBS ) GIBCO

神經生長因子 Nerve Growth Factor 25S GIBCO

碳酸氫鈉 Sodium bicarbonate 六和

聚離胺酸 Poly-L-Lysine 六和

乙醇 Ethanol 六和

28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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28

2-3 Sneddon model 和 Non-Hertzian approach

本實驗所計算細胞彈性係數的方法為 Sneddon model 和 Non-Hertzian

approachSneddon model 為傳統計算彈性體接觸模型 Hertz model的修

正模型Non-Hertzian approach為考慮不同幾何形狀探針及不同方法來計

算細胞彈性係數以下為兩方法的介紹

2-3-1 Sneddon model

1882年 Hertz提出兩個完全彈性圓形體的接觸彈性力學模型[19]其

中假設

1 兩物體接觸過程具有連續性且接觸面積為非一致性

2 接觸區域與接觸半徑相對於物體尺寸為極小量

3 接觸過程兩物體表面無摩擦且不考慮黏滯性

Sneddon更進一步修正 Hertz model利用數學模型討論不同幾何形狀

剛體施加負載於彈性平板得到剛體幾何形狀接觸面積負載力量與

凹陷深度的關係[20]近年來許多學者在探討細胞的機械特性時利用

Sneddon 所推導的尖錐型探針與彈性平板之間的凹陷深度關係計算細胞

的彈性係數圖 2-16為尖錐型探針與細胞間的水平投影凹陷面積凹陷

面積和凹陷深度之關係為(2-3)式[24]

29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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29

)(δφ

δ

F

圖 2-16尖錐型探針與細胞之間的凹陷面積示意圖

( ) 22

tan2δ

π

αδφ = (2-3)

其中 ( )δφ 為凹陷面積 ( indentation area)δ為凹陷深度( indentation

depth)α為探針尖端半錐角( half-cone angle)

將(2-3)式計算之各點的凹陷深度代入(2-4)式[26]得到尖錐型探針造

成的各點水平面投影凹陷面積經由 Sneddon model(2-4式)可計算出細胞

的彈性係數

( ) aEF δφν

π21 minus

= (2-4)

其中F為壓痕力量(applied force) ν為蒲松比( Poisson ratio ) aE 為表面

楊氏係數(apparent Youngrsquos modulus )

30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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30

由懸臂樑變形量推算探針施予細胞的垂直作用力兩者為線性關係

(2-5式)的θ相同於圖 2-19之θ

θcosdkF c= (2-5)

其中 ck 為懸臂樑彈性係數( spring constant )d為探針偏折( Deflection )

θ為懸臂樑探針夾角( tip angle)

將(2-3)式(2-5)式代入(2-4)式得到(2-6)式[26]

( ) ac Edk δφν

πθ 21

cosminus

=

2

2

tan2cos)1(

αδ

θνπ dkE ca

minus= (2-6)

2-3-2 Non-Hertzian approach

Sneddon model是考慮探針的幾何形狀為尖錐形但實際 AFM探針幾

何形狀並非為尖錐形探針的頂部具有一個微小圓錐形狀的球頭(此型探

針圓錐曲率半徑為 15nm)如下圖所示

圖 2-17 探針形狀

1994年Briscoe提出鈍錐形狀(Blunt-cone)的探針施於彈性體時凹陷深

度與凹陷面積的關係[21]凹陷面積與鈍錐形狀示意圖為圖 2-18其中

過渡半徑 b 為鈍錐所造成的接觸半徑與鈍錐半徑有關其值為

)(cos2 αsdotR 關係式為(2-7)式

31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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31

)(δφ

F

δ

圖 2-18鈍錐形狀探針與彈性體的凹陷量示意圖

( )

minus+minus+

minus

minus=

Rbabba

Ra

abaa

3tan2)(

3

arcsin2tan2

2

2222

3

2

α

πα

δπ

δφ

(2-7)

其中 ( )δφ 為凹陷面積(indentation area)δ為凹陷深度( indentation depth)

R 為尖端圓錐半徑(half-cone radius)α 為探針尖端半錐角(half-cone

angle)b 為過渡半徑(transition radius)a 為接觸半徑(contact radius)

且 ba gt

另外 1999 年 Yin 等人利用微小變形理論(infinitesimal deformation

theory)配合有限元素法(finite element method)討論三種不同的理論模式之

生物材料壓痕力量與凹陷面積的關係經由曲線擬合計算出來的楊氏係

32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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32

數加以比較[24]並在 2006年將之應用於內皮細胞機械特性量測[28]

其方法是考慮一個完全彈性的半無窮平板受到非對稱剛體探針壓痕

時由無窮小變形理論得知壓痕力量凹陷面積與廣義彈性係數的關係

為(2-8)式而將得到的凹陷面積曲線利用最小平方法(least-squares method)

對壓痕力量曲線作曲線擬合(curve fitting)由(2-9)式作為目標函數得到

(2-9)式求出最佳廣義彈性係數 ~E [28]

EF ~)(2 δπφ= (2-8)

( )( )2

1~

~2minarg~ sum=

minus=n

iiiE

EFE δφπ (2-9)

其中F為壓痕力量(Applied force) ( )δφ 為凹陷面積( Indentation area)

E~為廣義彈性係數(generalized elastic modulus)n為資料的總數共 1000

點

得到的最佳的廣義彈性係數 ~E 此值與真正的表面楊氏係數關係為(2-10)

式[28]

2 ~)1(2 EEa νminus= (2-10)

其中 ν 為蒲松比 (Poisson ratio) ~E 為最佳廣義彈性係數 (best-fit

generalized elastic modulus) aE 為表面楊氏係數 (apparent Youngrsquos

modulus)

33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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33

2-4 神經細胞力學實驗

本研究目的是為了求得真實 PC12神經細胞本體與神經軸突的表面形

貌與局部的機械特性研究方法是以接觸模式量測細胞表面形貌得到

影像之後根據不同的細胞本體與軸突高度做單點壓痕藉由探針試樣之

間的距離與探針偏折程度的關係由Hertz model和Non-Hertzian approach

計算細胞不同部位的機械性質加以比較整體實驗架構如圖 2-19

圖 2-19 神經細胞力學實驗架構

34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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34

2-4-1實驗方式

本研究量測模式是以 AFM之接觸模式求得真實神經細胞本體與神經

軸突形貌在量測開始之前決定探針作用於細胞的下壓力是非常重要

因為力量太大使探針將整個細胞刮離培養皿造成量測動作無法繼續

太小會使探針無法克服與細胞之間的作用力造成細胞表面輪廓成像有

誤差本實驗適合的量測力量為 1~15 nN如圖 2-20為接觸模式回饋迴

圈示意圖

圖 2-20 接觸模式回饋迴圈示意圖

2-4-2神經細胞本體定位量測

因為細胞高度範圍大約 0~4 μm (壓電掃瞄器 Z 軸的最大位移為 55

μm)高度起伏大之試樣適合用定力模式成像擷取高度圖(height 圖)的

影像來作為實際細胞的形貌為了使成像更清晰可以利用增加回饋增益

調整壓電掃描器修正的速度在本研究中利用多次重複實驗後發現將

回饋增益(FB gain)設定為 2~25 時而成像的結果會較清晰如圖

2-21(A)

35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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35

2-4-3 神經軸突定位量測

由生理解剖學得知神經軸突最大高度約 05~1 μm假如擷取高度圖會

使得表面形貌的影像不明顯故量測軸突時利用定高模式擷取探針偏

折電流訊號(DFL 圖)回饋增益( FB gain )設定為 01~02壓電掃描器則

維持一定的高度如圖 2-21(B)

圖 2-21 (A)神經細胞本體定位量測(B)神經軸突定位量測

2-4-4 力-距離曲線(force-distance curve)

當原子力顯微鏡在接觸模式下完成神經細胞位置的定位對不同區

域作壓痕測試時探針與試樣表面慢慢接觸依照量測環境(氣相與液相)

的不同兩者之間產生的作用力可能包含兩種或兩種以上(凡得瓦力毛

吸管力吸附力hellip等等)而這些作用力的總合會使探針產生偏折為了

呈現這些力量的表現可以利用力-距離曲線(force-distance curve)來描

述該曲線是利用探針對細胞做單點壓痕藉由探針試樣之間的距離與

探針偏折程度的關係得知作用力的表現以下為力-距離曲線說明分

為接近部分與遠離部分如圖 2-22所示圖中橫軸表示探針針尖與細胞

36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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36

之間的距離即掃描器 z軸位置而縱軸表示懸臂樑的偏折量則

(1) A處表示壓電掃描器慢慢下降時探針針尖與細胞沒有接觸故

懸臂樑也沒有彎曲

(2)當到達B處時壓電掃描器下降到剛好碰觸到細胞表面探針針尖

瞬間接觸細胞使懸臂樑開始彎曲

(3) C點為壓電掃描器繼續下降至最低點時懸臂樑偏折量到達最高

點造成的細胞凹陷量也最大

(4) D點處為壓電掃描器開始上移由於壓電材料遲滯( hysteresis)的現

象會與原來的路徑有差異當懸臂樑探針瞬間脫離細胞表面時因

細胞具有黏滯性探針針尖與細胞會突然分開(E點)

(5) 最後壓電掃描器繼續上移懸臂樑會恢復尚未形變的狀態(F點)

圖 2-22試片探針間之距離與探針的形變量的關係

37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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37

2-4-5 細胞力學特性量測

神經細胞包含了細胞骨架(cytoskeleton)微管(microtubule)肌凝蛋

白(myosin)肌動蛋白(actin)以及神經纖維(neuron filament)而這些蛋白

質微纖相互結合後建構出整體神經細胞的外型因此神經細胞不同區域

的彈性與這些物質的分布的狀態相關對神經細胞做單點壓痕時探針

接觸時細胞便會受壓而凹陷因為細胞並非為剛體探針撓屈量與細胞

凹陷深度之關係為下圖

zZθ

θ

d

zδ

zδ zd

圖 2-23探針與細胞凹陷示意圖

由懸臂樑探針垂直下壓量 Z偏折量 d與細胞凹陷深度 δ之間的關係

如(2-11)式其中θ為探針與水平的夾角

zZz dZ δ+=

θδ cosdZdZ zZZz minus=minus=rarr (2-11)

本實驗是探討細胞彈性特性故力-距離曲線是選擇接近部分得到

曲線結果為圖 2-24圖 2-24 (A)為探針的偏折量與垂直下壓量關係由

探針偏折量可以推算懸臂樑探針施予細胞作用力力量大小為探針彈性

係數乘上偏折量圖 2-24 (B)為壓痕力量與垂直下壓量關係

38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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38

0ZiZ

0d

id

0ZiZ

0f

if

圖 2-24壓痕測試後的力-距離曲線

39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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39

探針開始接觸細胞為 C點此點為探針垂直下壓量與偏折量的原始

點透過公式(2-12)計算出壓電掃瞄器在不同高度下相對於探針不同的偏

折量而計算出每一位置的細胞凹陷深度

iii ddZZ δθ +minus=minus cos)( 00

( ) ( ) θδ cos00 ddZZ iii minusminusminus= 321=i (2-12)

iZ 探針垂直下壓量 0Z 初始探針垂直下壓量

id 探針偏折量 0d 初始探針偏折量

iδ 凹陷深度 θ探針與水平的夾角

在神經細胞本體定位與神經軸突定位後在定位圖內選擇不同高度

對該高度做單點壓痕測試得到該點的力-距離曲線後經由 Sneddon model

和 Non-Hertzian Apprach分析結果整理在第三章所示本實驗假設細胞

為完全彈性體蒲松比(Poisson ratio)假設為 05

40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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40

3 第三章 結 果

本研究結果分為廣泛範圍 PC12神經細胞量測(包含細胞本體與軸突)

與密集範圍細胞本體的單點壓痕試驗由得到的力-距離曲線探討不同探

針幾何形狀對壓痕面積影響及各區域細胞所受壓痕力量利用 Sneddon

model和 Non-Hertzian approach推算出本身的機械性質加以比較建立神

經細胞整體的力學模型

3-1 PC12神經細胞本體廣泛範圍量測結果

3-1-1細胞區域定義

本實驗室之前研究 3T3纖維母細胞時發現細胞不同區域機械特性有

明顯的差別[27]故本研究對不同的細胞高度任選量測點作壓痕測試而

點與點之間距離非常遠故稱廣泛量測最後推算該細胞不同區域的機

械性質進行討論圖 3-1為 AFM定力模式下量測單一細胞的高度圖圖

3-2為細胞區域的定義依照細胞的高度分為細胞核區細胞本體細胞

邊緣

圖 3-1 細胞高度圖

41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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41

圖 3-2 細胞區域劃分圖

因為對細胞進行單點壓痕時所得到的偏折量為光感測器接收的電流

訊號故先對培養皿作壓痕測試得到偏折距離與電流訊號的關係經過

單位換算後不同高度所得到的相對力量曲線為圖 3-3細胞各區域每點的

壓力與壓痕深度的關係如圖 3-4發現在細胞邊緣區域所受到的壓痕力量

為最大細胞本體區域次之細胞核區域最小

圖 3-3 各區域力-距離曲線比較

42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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42

圖 3-4各區域力量與壓痕深度關係之比較

3-1-2 Sneddon model結果

將所得到壓痕力量與壓痕面積的數據代入 Sneddon model 推算各區

域的彈性係數依不同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域

做比較各區域楊氏係數結果見圖 3-5圖 3-6 和圖 3-7由 Sneddon

model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm時每區域的楊

氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕深度大於 50nm

時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而漸漸降低收斂於一個定值由文獻[26]

指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但從所得到

每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但收斂於定

值的情況不多

43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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43

圖 3-5 細胞區域 Nucleus楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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44

圖 3-6 細胞區域 Cell body楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

Height

Height

45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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45

圖 3-7細胞區域 Edge楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(B)

(A)

Height

Height

46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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46

3-1-3 Non-Hertzain Approach結果

由每點單點壓痕的力-距離曲線所得到的壓痕力量與壓痕面積關係具

有相同的趨勢由(24)式移項得到最小平方法的目標函數為(25)式而求

出最佳廣義彈性係數如圖 3-8

F

( ) ~2 Eiδφπ

圖 3-8廣義彈性係數擬合結果圖

將所求得最佳廣義彈性係數代入(27)式推算各細胞區域的表面楊氏

係數平均與標準誤差結果如表 3-1

47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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47

表 3-1各細胞表面區域楊氏係數關係

Nucleus Cell body Edge H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

H

(nm)

Ea

(kPa)

30190 1435 15360 375 8580 6866

31360 711 17590 3195 8640 8213

32490 542 20750 225 9570 7878

34630 1361 25210 2521 9770 6445

34640 935 26580 216 12580 6424

35790 1243 27650 2787 13280 3741

ave 1038plusmn365 ave 2777plusmn608 ave 6595plusmn158

因兩個 model所考慮的探針幾何形狀不相同比較兩者所造成的壓痕

面積的差異圖 3-9結果如發現鈍錐探針在各細胞區域壓痕面積最大時

約比尖錐探針少 24

圖 3-9 不同探針形狀所造成的壓痕面積

48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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48

3-1-2 與現有文獻結果比較

因為由 Sneddon model計算出表面楊氏係數的範圍較大各曲線收歛

值不同很難決定一個能比較的數值故選定由 Non-Hertzian approach

推算表面楊氏係數結果值與文獻做比較而文獻中都是以原子力顯微鏡

來量測細胞的機械特性與其比較發現本實驗細胞核區的結果略大於文

獻而邊緣區域結果則是較接近而且從標準誤差觀察楊氏係數範圍與

文獻相同都是較大

表 3-2各細胞楊氏係數研究結果

Cell Type Youngrsquos

Modulus(kPa) Author Year

Human platelets Nucleus 15~40

Edge 1000 Radmacher et al 1996

Chicken cardiocytes Cell body 50~300 Hofman et al1997

3T6 mouse embryo Nucleus 18

Edge 200~600 Ricci et al 1997

Motile 3T3 Edge 30~120 Rotsch et al 1999

NIH 3T3

mouse embryo

Nucleus 64~71

Cell 60~303

Edge 300~897

Lee2005

PC12 cell

Nucleus72~145

Cell body214~379

Edge401~837

current study

49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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49

3-2 PC12神經細胞軸突廣泛範圍量測結果

3-2-1 神經軸突區域定義與量測結果

因為 PC 12細胞加入 NGF誘導出神經軸突的長度不一由數微米至

數十微米不等本實驗選擇軸突長度大約 30~50μm為量測試樣依據離

細胞本體的遠近距離分成近端(Proximal)中端(middle)末端(Distal)為量

測區域由 AFM 利用定高模式下所量測到神經軸突各區域的結果如圖

3-10

10 um

Axon regionProximal

Axon regionMiddle

Axon regionDistal

圖 3-10軸突各區域量測結果

50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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50

從量測結果發現神經軸突在末端的寬度較近端中端寬大而高度則

是略同而得到軸突影像後即對各區域進行單點壓痕測試因為軸突高

度約 05~1um為了作單點壓痕時不受到基底影響故選定的量測點盡量

為軸突中間較高的位置圖 3-11為各區域的力量曲線比較

圖 3-11軸突各區域力-距離曲線

軸突各區域做單點壓痕時壓痕力量與壓痕深度的關係為

圖 3-12軸突各區域壓痕力量

51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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51

3-2-2 Sneddon model結果

將所得到的數據帶入 Sneddon model 計算各區域的彈性係數依不

同壓痕深度分成 20nm~50nm50nm~500nm 兩區域結果如圖 3-13~圖

3-15 所示計算結果與神經細胞本體所得結果趨勢相同壓痕深度

20nm~50nm 時表面楊氏係數都異常的高而壓痕深度大於 50nm 時隨

著壓痕深度增加而漸漸收斂但是有些曲線收斂的情形並不平滑推斷

原因可能為實驗環境溫度變化及機械震動造成探針微小熱擾動現象

圖 3-13神經軸突近端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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52

圖 3-14神經軸突中端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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53

圖 3-15神經軸突末端區域表面楊氏係數結果

(A)凹陷深度為 20nm~50nm (B) 凹陷深度為 50nm~500nm

(A)

(B)

54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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54

3-2-3 Non-Hertzian approach結果

由力-距離曲線得到壓痕力量與壓痕面積的關係利用 25 式求出廣

義彈性係數後代入 27式求出表面楊氏係數下表為神經軸突各區域楊

氏係數的量測結果

表 3-3軸突各區域楊氏係數的量測結果

Proximal Middle Distal

Width 2~4 um

Width 1~3 um

Width 5~8 um

aE (kPa)

aE (kPa)

aE (kPa)

852 711 805

1053 915 951

1456 1002 1215

1510 1094 1342

1779 1158 1358

1891 1183 1447

1426 plusmn 404 1016 plusmn 167 1186 plusmn 254

利用 Non-Hertzian approach 推算出之神經細胞本體與神經軸突結果

做比較如下表所示

表 3-4神經細胞本體與神經軸突的楊氏係數結果比較

Cell region Axon region

Nucleus 1038 plusmn 365 kPa Proximal 1426 plusmn 404 kPa

Cell body 2777 plusmn 608 kPa Middle 1016 plusmn 167 kPa

Edge 6595 plusmn 158 kPa Distal 1186 plusmn 254 kPa

55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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55

3-3 PC12神經細胞本體密集範圍量測結果

近年來許多研究者對多種細胞做特定物質螢光染色試驗[23]發現在

細胞邊緣的地方分布許多肌動蛋白而其蛋白質的分布與此區域的機械

特性有相當大的影響因為廣泛範圍量測不能明顯表現細胞邊緣具有纖

維結構的現象故本實驗選定一個小區域範圍作壓痕試驗觀察其範圍

內表面楊氏係數分布稱為密集範圍量測本實驗是以 Non-Hertzian

approach分析

3-3-1 神經細胞本體密集區域定義

在三個不同細胞區域選定一個 3um x 3um 的小範圍區域在範圍

內選取九個點作單點壓痕每點的之間的間隔為 1um如圖 3-16所示

圖 3-16 細胞小區域示意圖

56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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56

3-3-2 神經細胞本體密集區域量測結果

將量測結果以立體圖來顯示三個區域每量測點所得到表面楊氏係數

的趨勢如圖 3-17所示發現結果與廣泛範圍量測類似在邊緣區域楊

氏係數最高細胞本體區域次之細胞核區域最低如表 3-5所示而就

從結果來觀察細胞各區域表面楊氏係數分布範圍把九個量測點成水平

排列發現在細胞核區與細胞本體並變化不大但從細胞邊緣資料來看

此區域變化明顯因此推斷在此區域可能探針有壓到肌動蛋白或較硬的

蛋白質圖 3-18所示但六筆實驗結果中有兩組細胞邊緣楊氏係數變化

較不明顯則是推斷該區域沒有壓痕到肌動蛋白或較硬的蛋白質如圖

3-22圖 3-23

表 3-5細胞小區域量測結果

Cell region Nucleus

(kPa)

Cell body (kPa)

Cell edge

(kPa)

1124 plusmn 170 3690 plusmn 533 8564 plusmn 2255

665 plusmn 131 2379 plusmn 413 7763 plusmn 2445

935 plusmn 207 3422 plusmn 833 6648 plusmn 1257

1637 plusmn 196 3214 plusmn 541 7431 plusmn 1861

1721 plusmn 396 2879 plusmn 923 6579 plusmn 811

Data

Number

1273 plusmn 197 2341 plusmn 816 6554 plusmn 546

Average 1225 plusmn 434 2988 plusmn 841 7256 plusmn 1771

57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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57

58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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58

圖 3-17(A)細胞核區(B)細胞本體(C)細胞邊緣表面楊氏係數分布

N1

圖 3-18 試樣 N1三個細胞區域資料圖

59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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59

N2

圖 3-19 試樣 N2三個細胞區域資料圖

N3

圖 3-20試樣 N3三個細胞區域資料圖

60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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60

N4Y

oung

s m

odul

us (k

Pa)

圖 3-21試樣 N4三個細胞區域資料圖

N5

圖 3-22試樣 N5三個細胞區域資料圖

61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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61

N6

圖 3-23試樣 N6三個細胞區域資料圖

62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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62

4 第四章 討 論

現有細胞力學文獻中大多是探討多種細胞本體的機械特性對於神

經細胞機械性質方面討論較少幾乎都為各種基質對神經軸突生長的影

響[45]而本研究目的是利用力-距離曲線分析 PC12神經細胞本體機械性

質在將結果與文獻中不同細胞做比較以驗證本研究的可信度4-1節

比較本研究與先前實驗方法的差異說明本實驗的改良之處4-2節探討

AFM 量測過程中成像誤差4-3 節簡述細胞內部構造理論與實驗結果驗

證並提出神經細胞力學模型的假說4-4 節比較由 Sneddon model 與

Non-Hertzian approach 所推算的結果之可靠度

4-1 與先前量測方法比較

4-1-1 先前量測方法介紹

本實驗室先前研究也是利用原子力顯微鏡量測細胞的機械特性試

樣為 3T3纖維母細胞其方法為將細胞固定後擷取高度訊號(高度圖)與偏

折訊號(電流變化圖)量測模式採用定高模式掃描時 FB Gain參數值設

定在 03~05量測示意圖如下

圖 4-1 先前方法量測示意圖

63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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63

由探針垂直位移量 Z偏折量 d與凹陷深度 δ之間的關係如(2-11)

式將高度訊號當為探針垂直的下壓量偏折訊號代表探針的偏折量

量測完成後對培養皿作壓痕測試由力-距離曲線得到探針偏折訊號與垂

直位移的線性關係將偏折訊號(nA)換算成高度距離(nm)關係經由 41

式計算出每量測點的凹陷深度細胞凹陷深度透過 Sneddon model(42式)

推算 3T3纖維母細胞表面楊氏係數其結果與高度的關係為圖 4-2

圖 4-2細胞截面楊氏係數分佈圖形(Dish)

由先前方法所量測的結果3T3纖維母細胞細胞核區域楊氏係數介於

64~71kPa細胞本體區域介於 66~303kPa細胞邊緣區域介 30~897kPa

4-1-2 方法比較與討論

為了與先前方法做比較本實驗也是將細胞分成三個區域作討論已

詳述於 2-4小節表 4-1為兩種方法比較

64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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64

表 4-1方法比較

實驗方法 本實驗 先前方法

細胞種類 PC12 cell NIH 3T3 mouse embryo

量測模式 接觸式 接觸式

量測方法 細胞定位+單點壓痕 細胞定位

成像模式 定力模式 定高模式

FB Gain 20 ~ 25 03 ~ 05

訊號來源 高度圖 + 力-距離曲線 高度圖 + 電流變化圖

計算公式 Sneddon model

Non-Hertzian approach Sneddon model

計算結果

(kpa)

Nucleus7~14

Cell body21~37

Edge40~83

Nucleus 5~7

Cell body66~303

Edge 30~90

先前方法在細胞定位量測部分利用壓電掃瞄器高度變化與探針變形

量的關係即可以推算出其表面楊氏係數此方法對於計算細胞機械特性

非常方便且能在短時間就能得到整個細胞截面楊氏係數分佈但量測

時設定 FB Gain的值為 03~05壓電掃瞄器高度變化靈敏度很低這樣

的設定下所成像的高度圖可能並非為細胞真實高度則會比實際的高度

低矮很多而相對探針偏折程度會變大使細胞所受的下壓力增加凹

陷深度減小故此方法所推算的楊氏係數可能過大本實驗的方法雖然

由兩個步驟才能得到細胞單點的楊式係數但是細胞定位時 FB Gain 設

定為 2~25(極限為 3)所得到的高度訊號為較接近細胞真實高度且此

訊號與推算表面楊氏係數沒有關係只是提供壓痕測試的定位圖真正

推算表面楊氏係數所需要的數據都由單點壓痕後才能得到故由本實驗

方法與先前方法相比較所得結果較能提供正確的數據

65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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65

4-2 AFM量測過程的成像誤差

在細胞定位過程探針瞬間接觸細胞時探針的下壓力加速度與掃

描方向會造成即時凹陷與變形此時所得的成像高度與實際高度會有些

微小差距[44]故本節討論此現象及計算凹陷量誤差

4-2-1 細胞即時凹陷深度求法

由單點壓痕測試得到的力-距離曲線得知表面壓痕力量及楊式係數

由 Sneddon model 公式推算量測時細胞的凹陷深度

)tan(2)1( 2

ανπ

δsdot

minussdotsdotsdot=

aEdk

(4-1)

細胞即時凹陷深度δ 主要受到探針下壓力與掃描加速度方向影

響而細胞變形如圖 4-3 中所示虛線為細胞原始的形貌實線為受力

後變形形貌而假設 ( )00 YX 為某點細胞原始的位置量測開始後該點受

掃描方向不同形變成 ( )11YX 與 ( )22 YX 位置

( )00 YX

Ff

θ

θ( )11YX

1δ( )00 YX

F

fθ

θ ( )22 YX2δ

圖 4-3細胞變形與下壓力加速度方向示意圖

66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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66

其中F為探針下壓力 f 為探針對細胞的作用力大小為質量乘加

速度 ( )maf = 經由 4-2式推算出即時凹陷深度

sdot+minus

=

sdotminusminus

=

)tan(2)]sin()cos()[1(

)tan(2)]sin()cos()[1(

2

2

2

1

αθθνπ

δ

αθθνπ

δ

a

a

EfF

EfF

(4-2)

其中 1δ 為圖 4-3 (A)條件下之凹陷深度而 2δ 為圖 4-3 (B)條件下之凹陷深

度

4-2-2 細胞高度修正

將廣泛範圍所選定的細胞高度經由(4-2)式修正其結果如下表假

設細胞為對稱性由上表數據依細胞高度由小到大約略描繪原始高度與

成像高度示意圖如圖 4-4 所示在細胞核區高度增加約 10細胞本

體區增加約 7細胞邊緣增加約 5雖然此圖是經表 4-2 的數據以曲

線擬合方式而得並非為單顆細胞實際高度與成像高度但可以表現其

兩者高度有明顯的誤差現象發生

此方法利用高度圖與力-距離曲線配合 Sneddon model公式還原細胞

原始高度對欲知 AFM成像探討影響細胞形狀變形原因如熱應力藥

物應變場等等這方法能提供很大的幫助

67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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67

表 4-2 細胞高度修正結果

region Nucleus Cell body Edge

Height Original

(nm)

recovering

(nm) Original

(nm)

recovering

(nm) Original(

nm)

recovering

(nm)

3019 3290 1536 1662 858 977

3136 3556 1759 1914 864 969

3249 3748 2075 2257 957 1068

3463 3761 2521 2721 977 1101

3464 3817 2658 2835 1258 1356

Data

number

3579 3900 2765 2934 1328 1489

圖 4-4 細胞原始高度與成像高度示意圖

68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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68

4-3 神經細胞力學模型

本實驗選擇兩種範圍大小呈現神經細胞力學模型廣泛範圍量測推算

區域機械性質分布大小密集範圍量測可表現出區域纖維組織特性

4-3-1神經細胞構造理論

藉由最新的細胞與分子生物學技術( cellular and molecular biology )的

應用細胞內部的構造與功能一一被發現概括來說細胞本體由細胞

核細胞質細胞膜與各種胞器所構成其中形成細胞整體結構的重要

角色就是細胞骨架 (cytoskeleton)分為微絲 (microfilaments)中間絲

(intermediate filaments)與微小管(microtubules)而肌動蛋白(actin)是微絲

的主要成分之一分佈在細胞周圍且非常密集而中間絲負責連結細胞

核與細胞膜介於細胞核區與細胞邊緣之間微小管則由細胞核向外呈

放射狀分佈依Alberts在 1994年所提出的細胞內部構造示意圖如下[45]

圖 4-5 細胞骨架分佈示意圖

(a) 肌動蛋白 (b)中間絲 (c)微小管

69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

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本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

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近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

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79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

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使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

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建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

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結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

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表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

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69

4-3-2廣泛範圍量測結果

由上節理論模型印證細胞骨架分佈的位置發現細胞核區並沒有細

胞骨架分布的情形在細胞本體區域有中間絲與微小管的分布雖然沒

有非常密集但其本身為建構細胞形貌的重要成分所以中間絲與微小

管都具有相當的強度故此區域楊氏係數略高於核區發現肌動蛋白明

顯集中於細胞邊緣且非常密集此區域高度又較低較能直接接觸到微

絲因此邊緣區域的楊氏係數大於細胞本體和細胞核區為合理的現象

為了避免細胞厚度過薄時探針形變量會受到基質硬度的影響因此本

研究選擇量測細胞高度高於 05um

圖 4-6 軸突骨架分佈示意圖

經由 NGF 誘導後神經軸突其表面的細胞膜為軸膜(axolmma)內

含的胞質稱為軸質(axoplasm)軸質內包含大量的微小管 [45]如圖 4-6

所示由神經細胞本體與神經軸突的構造互相比較在細胞核區與神經

軸突的構造很相似都是由微小管所組成由表 3-4發現細胞核區的機

械性質也與軸突非常接近故本實驗所推算神經軸突的楊氏係數似乎合

理不過神經軸突可能還是有其他纖維可能會影響機械性質但是這些

纖維的直徑遠小於探針鈍錐曲率半徑所以原子力顯微鏡無法分析這些

的纖維特性

70

4-3-3細胞密集區域量測討論

4-3-3-1 量測選擇點之間的影響

由壓痕深度與壓痕面積的關係最大壓痕面積約 30000 ~70000nm

假設壓痕面積為 2rπ 所造成的壓痕半徑約 90~150nm而本實驗選取的

量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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量測點之間間隔為 1μm故每點的壓痕測試不會互相影響所以不會有

對同一量測點作壓痕測試的現象發生

4-3-3-2 表面楊氏係數分布

從密集範圍量測結果與廣泛範圍結果類似在邊緣區域表面楊氏係

數平均最高本體區域次之細胞核區最低而觀察細胞各區域的分布

範圍發現在細胞核區與細胞本體變化不大核區推測是因構造多為染

色體核仁核質等軟性物質所組成調控細胞的生長分化死亡

並無細胞骨架分布所以表面楊氏係數較低且變化性不大而本體區域

雖然分布許多中間絲與微小管但可能壓痕測試時凹陷深度不夠深與細

胞骨架分布不夠密集結果與核區相同在細胞邊緣區域前四筆結果顯

示(圖 3-18~24)表面楊氏係數變化非常明顯推測此區域因細胞高度較

低所選擇量測範圍內有肌動蛋白或較硬的蛋白質分布但後兩筆的結

果(圖 3-22~23)變化較不明顯則是推斷該範圍則沒有微絲分佈所以密

集範圍的量測方法雖然能將細胞邊緣區域纖維結構表現出來但不是

每次都能得到表面楊氏係數變化大的結果假設這方法能配合螢光染

色由染色可以清楚看出肌動蛋白或其他蛋白質分佈的情形利用密集

區域壓痕測試更清楚表現細胞邊緣區域的纖維結構組織特性圖 4-7 為

推測神經細胞力學模型細胞核區較細胞骨架分佈故表面楊氏係數分

布大約 7~14kPa本體區域雖有細胞骨架分佈但不密集故此區機械特性

略高於核區約 21~37kPa在細胞邊緣骨架分佈密集所以表面楊氏係數

71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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71

變化範圍很大約 40~83kPa 而軸突區域分布許多微小管使的表面楊氏係

數約 9~20kPa

圖 4-7推測神經細胞力學模型

4-4 由 Sneddon model 推算之楊氏係數

由 Sneddon model推算楊氏係數結果顯示在壓痕深度 20nm~50nm

時每區域的楊氏係數都異常的高對細胞為彈性體是不太合理壓痕

深度大於 50nm時楊氏係數會隨著壓痕深度增加而收斂趨於一個定值

由文獻[23]指出此值不受基質的影響為真正細胞的表面楊氏係數但

從所得到每條曲線結果雖有隨著壓痕深度增加而漸漸降低的現象但

趨於定值的情況不多故本節將討論實驗所得到的數據探討整個凹陷

深度與楊氏係數的關係找出真正的表面楊氏係數

72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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72

4-4-1 淺凹陷深度討論

由實驗結果發現當凹陷深度在很小(0~50nm)的時候所推算的楊氏

係數非常大甚至達到 GPa的值所以以下提出可能造成的原因有三

一 凡得瓦力(Van Der Waals Force)

AFM是感測探針與試樣兩原子間的凡得瓦力來呈現其表面特性當

兩原子距離比原子半徑大時為吸引力而當兩原子距離比原子半徑小時

會產生排斥力由包利互斥原理(Pauli exclusion principle )證明沒有兩個

相同粒子可以同時處在相同的能量下所以探針靠近細胞時兩者之間

排斥力漸增而瞬間接觸細胞會產生很大的作用力施壓於細胞則此時

施壓力量跟凹陷深度呈非線性關係造成結果產生誤差

二 熱擾流(thermal noise)

AFM靠著微懸臂樑探針的偏折量來決定細胞表面的形貌但是利用

此方法會出現一些物理限制的特性由布朗運動特性來看懸臂樑受到

液體分子來自四面八方連續撞擊使探針尖端會產生連續但不規則地擺

動其擺動幅度與溫度有關稱為熱擾動(thermal noise) 現象若探針剛

接觸細胞時擺動過大時造成細胞微小凹陷深度可能會有量測上誤差

使其結果產生錯誤

三 吸附力(adhesive force )與毛細管力(capillary force)

整個實驗過程是在液態中進行細胞與探針表面都會覆蓋著一層水

層當探針剛要接觸細胞時覆蓋在兩個表面水層之間會產生擬結現象

這會產生很大的作用力將探針吸向細胞表面使細胞很快產生微小凹陷

深度而其作用力可能包含吸附力毛吸管力等各力的總和故此範圍

結果可能會出現誤差

73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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73

從得到的力-距離曲線來看許多曲線都有類似圖 4-8在剛接觸細胞

探針得確會有些微下降現象發生故本實驗假設當凹陷深度淺時計算

的結果誤差較大為合理

圖 4-8 力-距離曲線誤差示意圖

4-4-2 深凹陷深度討論

利用 Sneddon model 所推算的表面楊氏係數結果(以下稱 Sneddon

result)會隨著凹陷深度而降低最後趨近於一個定值由本研究的結果雖有

這樣的趨勢但當凹陷深度達最大值時曲線雖然慢慢收歛卻很趨於一定

值所以將其結果與 Non-Hertzian approach 所推算的結果 (以下稱

Non-Hertzian result)相比較發現 Sneddon result 在凹陷深度較深的部分

與 Non-Hertzian result 非常接近如圖 4-9所示所以吾人在神經細胞本

體的 Sneddon result 選定 300~500nm 凹陷深度而神經軸突選擇

150nm~250nm 凹陷深度利用最小平方法算出最接近結果的單一值與

Non-Hertzian result做比較計算兩值的差異值

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

[1] 李宣書 物理雙月刊（廿四卷三期）pp430-4352001 年 6 月

[2] Burridge K Fath K Kelly Nuckolls G Turner C Annu Rev Cell

Biol vol4 pp 487-525 1988

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Medical School pp 1-673 1997

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of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth

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study by means of the magnetic particle method Part I Experimentalrdquo

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[16] Martin G Andreas R Martin S Juumlrgen Ruumlhe Johannsmann D

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[17] Hoben G et al ldquoQuantification of varying adhesion levels in Chondr

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30(5) pp703-12 2002

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atomic force microscoperdquo Biophysi J vol70 pp 556ndash567 1996

82

[23]Radmacher M ldquoMeasuring the elastic properties of biological samples

with the AFMrdquo IEEE Engineering in medicine and biology vol 16 Issue

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Measuring Mechanical Properties With Atomic Force Microscopyrdquo J

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mechanical dynamics of active and stable edges in motile fibroblastsrdquo

PNAS USA vol96 pp 921-926 1999

[26] MathurA ldquoEndothelial cardiac muscle and skeletal muscle exhibit

different viscous and elastic properties as determined by atomic

microscopyrdquo J of Biomechanics vol34 pp1545-1553 2001

[27] 李宗翰 單軸應變對 3T3 纖維母細胞機械特性影響之研究 國立成

功大學微機電系統工程研究所碩士論文

[28] Kevin D C Alan J S Frank C-P Yin rdquo Non-Hertzian Approach to

Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic

Force Microscopyrdquo Journal of Biomechanical Engineering vol 128 pp

176 -184 APRIL 2006

[29]Y C Fung ldquoBiomechanics Mechanical Properties of Living Tissues 2nd

edrdquo Springer-Verlag pp 277-292 1972

[30] J-L Fan J-Q Li M-S Ju and C-C K Lin ldquoIn vivo biomechanical

analyses of peripheral nervesrdquo Proc 2002 Conference on BME

Technology Kaohsiung December 14-15 2002

[31] RJ M-S Ju and C-C K Lin ldquoBiomechanics of damaged and injured

peripheral nervesrdquo Proc 2003 Conference on BME Technology

[32] Satcher Jr RL Dewey Jr CF Theoretical estimates of

mechanical properties of the endothelial cell cytoskeleton Biophysical

83

Journal vol 71 (1) pp 109ndash118 1996

[33] Coughlin MF Stamenovic D A prestressed cable network

model of the adherent cell cytoskeleton Biophysical Journal vol84 (2)

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[34] Boey SK Boal DH Discher DE Simulations of the e

rythrocyte cytoskeleton at large deformation I Microscopic models

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[35] Binning GH Rohrer H ldquoScanning tunneling microscopy from birth to

adolescencerdquo Rev Modern Physics vol 59 pp 615-619 1987

[36] Poggi M A Gadsby E D Bottomley L A ldquoScanning probe

microscopyrdquo Anal Chem vol76 pp 3429-3444 2004

[37] Morris V J A R Kirby A R Gunning A P ldquoAtomic force

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Publishing Company Amsterdamrdquo pp 1901-1921 1967

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[40] NT-MDT Corp SPM introduction httpwwwntmdtru

[41] 原子力顯微鏡成像中文簡易操作手冊成功大學醫學工程所生醫感

測實驗室

[42] Veeco Instruments httpswwwveecoprobescom

[43] Sader J E Larson I Mulvaney P White LR rsquorsquoMethod for the

Calibration of Atomic Force Microscope Cantilevers ldquoRevScivol

66 pp 3789-3798 1995

[44] Peter H Ilka R Holger E Michael S Wolfgang S Solon T

ldquoDefined adhesion and growth of neurones on artificial structured

substratesrdquo Electrochimica Acta vol 47 pp 299ndash307 2001

74

圖 4-9 Sneddon model result與 Non-Hertzian approach result 比較圖

由兩種結果方法所得到表面楊氏係數的結果來看在神經細胞本體

發現在細胞核區較為接近細胞本體次之細胞邊緣最低而神經軸突

各區域也是都是在標準誤差的範圍內所以本研究若量測區域表面楊氏

係數較小且平均時Sneddon result 和 Non-Hertzian result更為接近但

區域為較大且多變化時兩個方法推算的值相差較多如表 4-3表 4-4

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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82

[23]Radmacher M ldquoMeasuring the elastic properties of biological samples

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2 pp 47ndash57 1997

[24] Costa K D Yin F C ldquoAnalysis of IndentationldquoImplications for

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[25] Rotsch C Jacobson K M Radmacher M ldquoDimensional and

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功大學微機電系統工程研究所碩士論文

[28] Kevin D C Alan J S Frank C-P Yin rdquo Non-Hertzian Approach to

Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic

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176 -184 APRIL 2006

[29]Y C Fung ldquoBiomechanics Mechanical Properties of Living Tissues 2nd

edrdquo Springer-Verlag pp 277-292 1972

[30] J-L Fan J-Q Li M-S Ju and C-C K Lin ldquoIn vivo biomechanical

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Technology Kaohsiung December 14-15 2002

[31] RJ M-S Ju and C-C K Lin ldquoBiomechanics of damaged and injured

peripheral nervesrdquo Proc 2003 Conference on BME Technology

[32] Satcher Jr RL Dewey Jr CF Theoretical estimates of

mechanical properties of the endothelial cell cytoskeleton Biophysical

83

Journal vol 71 (1) pp 109ndash118 1996

[33] Coughlin MF Stamenovic D A prestressed cable network

model of the adherent cell cytoskeleton Biophysical Journal vol84 (2)

pp 1328ndash1336 2003

[34] Boey SK Boal DH Discher DE Simulations of the e

rythrocyte cytoskeleton at large deformation I Microscopic models

Biophysical Journal vol75 (3) pp 1573ndash1583 1998

[35] Binning GH Rohrer H ldquoScanning tunneling microscopy from birth to

adolescencerdquo Rev Modern Physics vol 59 pp 615-619 1987

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Publishing Company Amsterdamrdquo pp 1901-1921 1967

[39] Park Scientific Instruments Corp Users Guide to Autoprobe CP Part II

[40] NT-MDT Corp SPM introduction httpwwwntmdtru

[41] 原子力顯微鏡成像中文簡易操作手冊成功大學醫學工程所生醫感

測實驗室

[42] Veeco Instruments httpswwwveecoprobescom

[43] Sader J E Larson I Mulvaney P White LR rsquorsquoMethod for the

Calibration of Atomic Force Microscope Cantilevers ldquoRevScivol

66 pp 3789-3798 1995

[44] Peter H Ilka R Holger E Michael S Wolfgang S Solon T

ldquoDefined adhesion and growth of neurones on artificial structured

substratesrdquo Electrochimica Acta vol 47 pp 299ndash307 2001

75

表 4-3 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Nucleus Cell body Edge

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

kPa kPa kPa kPa kPa kPa

542 594 216 1512 3741 3485

711 728 225 1607 6424 3806

935 638 2521 1652 6445 3983

1243 1197 2787 1940 6866 5750

1361 1356 3195 2740 7878 6015

1435 1272 375 3491 8213 6241

1038plusmn370 964plusmn350 2777plusmn61 2157plusmn790 659plusmn1580 488plusmn 1249

表 4-4神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較表

Proximal Middle Distal

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

Non-

Hertzian

(kPa)

Sneddon

(kPa)

852 879 744 611 805 1268

1053 918 915 755 951 776

1456 876 1002 838 1215 188

151 928 1094 1121 1342 719

1779 1336 1158 999 1358 1124

1891 1416 1183 1147 1447 1057

1426plusmn404 1058plusmn250 1016plusmn166 912plusmn210 1186plusmn250 1137plusmn250

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

[1] 李宣書 物理雙月刊（廿四卷三期）pp430-4352001 年 6 月

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Medical School pp 1-673 1997

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atomic force microscoperdquo Biophysi J vol70 pp 556ndash567 1996

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different viscous and elastic properties as determined by atomic

microscopyrdquo J of Biomechanics vol34 pp1545-1553 2001

[27] 李宗翰 單軸應變對 3T3 纖維母細胞機械特性影響之研究 國立成

功大學微機電系統工程研究所碩士論文

[28] Kevin D C Alan J S Frank C-P Yin rdquo Non-Hertzian Approach to

Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic

Force Microscopyrdquo Journal of Biomechanical Engineering vol 128 pp

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edrdquo Springer-Verlag pp 277-292 1972

[30] J-L Fan J-Q Li M-S Ju and C-C K Lin ldquoIn vivo biomechanical

analyses of peripheral nervesrdquo Proc 2002 Conference on BME

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[31] RJ M-S Ju and C-C K Lin ldquoBiomechanics of damaged and injured

peripheral nervesrdquo Proc 2003 Conference on BME Technology

[32] Satcher Jr RL Dewey Jr CF Theoretical estimates of

mechanical properties of the endothelial cell cytoskeleton Biophysical

83

Journal vol 71 (1) pp 109ndash118 1996

[33] Coughlin MF Stamenovic D A prestressed cable network

model of the adherent cell cytoskeleton Biophysical Journal vol84 (2)

pp 1328ndash1336 2003

[34] Boey SK Boal DH Discher DE Simulations of the e

rythrocyte cytoskeleton at large deformation I Microscopic models

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[35] Binning GH Rohrer H ldquoScanning tunneling microscopy from birth to

adolescencerdquo Rev Modern Physics vol 59 pp 615-619 1987

[36] Poggi M A Gadsby E D Bottomley L A ldquoScanning probe

microscopyrdquo Anal Chem vol76 pp 3429-3444 2004

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Publishing Company Amsterdamrdquo pp 1901-1921 1967

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[40] NT-MDT Corp SPM introduction httpwwwntmdtru

[41] 原子力顯微鏡成像中文簡易操作手冊成功大學醫學工程所生醫感

測實驗室

[42] Veeco Instruments httpswwwveecoprobescom

[43] Sader J E Larson I Mulvaney P White LR rsquorsquoMethod for the

Calibration of Atomic Force Microscope Cantilevers ldquoRevScivol

66 pp 3789-3798 1995

[44] Peter H Ilka R Holger E Michael S Wolfgang S Solon T

ldquoDefined adhesion and growth of neurones on artificial structured

substratesrdquo Electrochimica Acta vol 47 pp 299ndash307 2001

76

Nucleus Cell body Edge0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Region

Non-Hertzian Approach

Sneddon model

圖 4-10 神經細胞本體 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

圖 4-11神經軸突 Sneddon result與 Non-Hertzian result比較示意圖

77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

[1] 李宣書 物理雙月刊（廿四卷三期）pp430-4352001 年 6 月

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[13] Charras G T Lehenkari P P Horton M A Ultramicroscopy vol 86

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[14] OliviberTAlbrechtO ldquoComparison of the mechanical properties of

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309-326 1997

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[16] Martin G Andreas R Martin S Juumlrgen Ruumlhe Johannsmann D

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atomic force microscoperdquo Biophysi J vol70 pp 556ndash567 1996

82

[23]Radmacher M ldquoMeasuring the elastic properties of biological samples

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2 pp 47ndash57 1997

[24] Costa K D Yin F C ldquoAnalysis of IndentationldquoImplications for

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[25] Rotsch C Jacobson K M Radmacher M ldquoDimensional and

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[27] 李宗翰 單軸應變對 3T3 纖維母細胞機械特性影響之研究 國立成

功大學微機電系統工程研究所碩士論文

[28] Kevin D C Alan J S Frank C-P Yin rdquo Non-Hertzian Approach to

Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic

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176 -184 APRIL 2006

[29]Y C Fung ldquoBiomechanics Mechanical Properties of Living Tissues 2nd

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[30] J-L Fan J-Q Li M-S Ju and C-C K Lin ldquoIn vivo biomechanical

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[31] RJ M-S Ju and C-C K Lin ldquoBiomechanics of damaged and injured

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[32] Satcher Jr RL Dewey Jr CF Theoretical estimates of

mechanical properties of the endothelial cell cytoskeleton Biophysical

83

Journal vol 71 (1) pp 109ndash118 1996

[33] Coughlin MF Stamenovic D A prestressed cable network

model of the adherent cell cytoskeleton Biophysical Journal vol84 (2)

pp 1328ndash1336 2003

[34] Boey SK Boal DH Discher DE Simulations of the e

rythrocyte cytoskeleton at large deformation I Microscopic models

Biophysical Journal vol75 (3) pp 1573ndash1583 1998

[35] Binning GH Rohrer H ldquoScanning tunneling microscopy from birth to

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[36] Poggi M A Gadsby E D Bottomley L A ldquoScanning probe

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[37] Morris V J A R Kirby A R Gunning A P ldquoAtomic force

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Publishing Company Amsterdamrdquo pp 1901-1921 1967

[39] Park Scientific Instruments Corp Users Guide to Autoprobe CP Part II

[40] NT-MDT Corp SPM introduction httpwwwntmdtru

[41] 原子力顯微鏡成像中文簡易操作手冊成功大學醫學工程所生醫感

測實驗室

[42] Veeco Instruments httpswwwveecoprobescom

[43] Sader J E Larson I Mulvaney P White LR rsquorsquoMethod for the

Calibration of Atomic Force Microscope Cantilevers ldquoRevScivol

66 pp 3789-3798 1995

[44] Peter H Ilka R Holger E Michael S Wolfgang S Solon T

ldquoDefined adhesion and growth of neurones on artificial structured

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77

4-4-3 Sneddon model 與 Non-Hertzian Approach 比較

Sneddon model 利用力-距離曲線得到每點對應的壓痕力量與凹陷深

度加上考慮尖錐幾何形狀的探針而推算細胞表面的楊氏係數其結果

範圍非常大又包含誤差值所以由點對點方法很難得到定值與其他壓痕

點做比較Non-Hertzian approach 一樣利用力-距離曲線來推算表面楊氏

係數由壓痕力量凹陷面積與凹陷深度的關係以曲線對曲線的關係

來得到其結果而推算值只有一個數值則可清楚表現該量測點的機械

特性而此數值跟傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model的結果又很

接近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生

化機轉之外Non-Hertzian approach 推算其結果相信會是另一項評估指

標

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

6 參考文獻

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83

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model of the adherent cell cytoskeleton Biophysical Journal vol84 (2)

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[41] 原子力顯微鏡成像中文簡易操作手冊成功大學醫學工程所生醫感

測實驗室

[42] Veeco Instruments httpswwwveecoprobescom

[43] Sader J E Larson I Mulvaney P White LR rsquorsquoMethod for the

Calibration of Atomic Force Microscope Cantilevers ldquoRevScivol

66 pp 3789-3798 1995

[44] Peter H Ilka R Holger E Michael S Wolfgang S Solon T

ldquoDefined adhesion and growth of neurones on artificial structured

substratesrdquo Electrochimica Acta vol 47 pp 299ndash307 2001

78

5 第五章 結論與建議

5-1結論

本研究改良先前量測細胞機械特性方法利用單點壓痕測試對 PC12

類神經細胞各區域進行量測經由 Non-Hertzian model 計算楊氏係數發

現在細胞核區約 1038 plusmn 365 kPa細胞本體約 2777 plusmn608 kPa細胞

邊緣約 6595 plusmn 1580 kPa軸突近端約 1588 plusmn 423 kPa中端約 1016 plusmn

116 kPa遠端約 1186 plusmn 254 kPa依細胞生理學的理論細胞骨架在

細胞核區分布的密度極低並隨著細胞骨架密度由細胞內部向外遞增

量測所得的楊氏係數也呈現此一趨勢特別是細胞邊緣區域肌動蛋白的

濃度變化也呈現相同的情況小範圍的量測方法更能呈現區域的纖維結

構特性細胞核區與細胞本體因細胞骨架數量較少且密度低表面楊氏

係數變化性都不大顯示兩區域機械特性為接近均質材料與軸突非常

類似但在細胞邊緣骨架密度高且交互排列所推算的表面楊氏係數變

化較大表現出該區域為纖維結構組織與理論相符

當使用 AFM成像細胞或軟性材料的表面形貌受到多方向的作用力

會使試樣產生變形而本研究引用一個方法利用高度圖與力-距離曲線配

合 Sneddon model公式還原試樣的原始高度對欲知 AFM成像探討熱應

力藥物應變場影響試樣形狀變形原因可能提供很大的幫助

本研究利用 Non-Hertzian Approach方法來推算神經細胞的表面楊氏

係數其結果與傳統計算細胞表面楊式係數 Sneddon model 的結果很接

近所以對於日後欲知細胞的機械特性除了細胞形態變化與內部生化

機轉之外Non-Hertzian Approach推算其結果相信會是另一項評估標準

79

5-2 建議

由於量測結果會受到熱擾動而產生誤差這誤差與實驗室空間的溫

度變化有很大的關係因為目前實驗機台處於開放空間因此實驗進行

時無法保持 375 2CO 的恒定狀態所以這是必須改進的第一步

對於人體內的神經系統來說每條神經束都包含很多神經軸突聚集

在一起所以而後可以藉由基質的塗抹方式不同如條列式或區塊式

使神經軸突群聚生長若能知兩根軸突間之相互影響的機械特性與實

際的神經系統更為接近對於模擬神經再生與修復更為準確

目前的量測過程一次掃描結束約需 30分鐘整個實驗需約花 2-3個

小時才能得到數據所以這段時間內細胞內部結構會產生變化如果能

建立一套即時的處理系統與精密的影像設備即可到量測在掃描過程中

及時的機械性質變化並且捕捉到過程中細胞形貌的改變給於得到的

結果做修正

本研究利用單點壓痕測試來推算細胞的機械特性這方法是屬於靜

態量測方式而細胞是具有黏彈性的物質利用這方法並不能很完全的

表現出其性質所以若能利用動態量測的方式由探針的振幅與相位的

改變來推算細胞楊氏係數與黏滯係數使神經細胞機械特性更加完整

80

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自 述

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